差示分光光度法测定药物制剂中的四环素

四环素是生物合成的广谱抗菌素。临床研究表明，病人服用四环素后，定时测定体液中四环素含量可诊断胃癌，四环素还可作为荧光探针用以诊断癌症。近年来，四环素还广泛被用作饲料添加剂，以增强动物的抗病能力。关于四环素的测定方法，已有许多报道，如微生物法、分光光度法差示导数光谱法、FIA、RHPL、ISE、吸附SV、三氯化铁比色法等。本文利用四环素与钻离子在PH为11.5的Na₂HPO₄－NaOH缓冲溶液中生成黄绿色络合物，并根据其光谱变化的牲性，采用差示光度法不经分离直接测定了药物制剂中的四环素。四环素浓度在0.80－25ug/ml范围内符合比耳定律。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

美析仪器v-1500分光光度计；PH－HJ908OB数字酸度计时北京海淀航天计算机公司）；XYJ80－2离心沉淀机（江苏医疗器械厂）。

盐酸四环素标准液：用标准品（中国药品生物制品检定所提供）配成2mg／ml的储备液，使用时用水稀释成0.2mg／ml；钻离子溶液：用CoCl₂·6H₂O配成1mg／ml的储备液，使用时稀释成0.1mg／ml；Na₂HPO₄－NaOH缓冲溶液。以上试剂均为分析纯，水为市售二次去离子水。

1.2  实验方法

于两支25ml的比色管中，分别加入0.2mg／ml的盐酸四环素标准使用液2.0ml，一支用水稀释至刻度作参比液，另一支加入0.1mg／ml的钴离子溶液2ml，Na₂HPO₄－NaOH缓冲2ml，用水稀释至刻度。前者置参比池中，后者置样品池中，于405nm处测其吸光度。

2  结果与讨论

2.1 实验条件的选择

络合物的形成受诸多因素的影响，本文对酸度，缓冲溶液的种类及用量、钴离子的用量、反应温度、反应时间等条件的影响作了讨论。

2.1.1  吸收光谱  将盐酸四环素标准使用液按实验方法处理后，在380－500nm波长范围内进行波长扫描。盐酸四环素在405nm处最大吸收，可作为测定波长。

2.1.2  酸度对络合物形成的影响   溶液的酸度对四环素与钴离子生成络合物影响较大。对不同酸度条件下络合物的形成进行了研究，在酸性、中性介质中，络合物不易形成。随着溶液PH值的升高，溶液颜色逐渐加深，吸光度逐渐增大。PH在10.5－13.0范围内吸光度最大且稳定；当PH>13.0，络合物的吸光度开始减小，这说明络合物在强碱性介质中开始离解，PH值越大，离解越历害。这是由于大量的OH－和钴离子形成了Co(OH)的络离子，促使四环素一钴离子络合物离解。故本实验选择pH11.5。》

2.1.3  缓冲溶液种类及用量

缓冲溶液的种类及用量对络合物的形成有一定的影响。在Na₂HPO₄－NaOH，H₃PO₄－柠檬酸－NaOH，NaOH等不同的缓冲体系中，以在Na₂HPO₄－NaOH缓冲液中络合物的吸光度最大且稳定，用量以控制在2ml最为合适，用量太小不利于络合物的形成，太大形成的络合物又开始离解。在H₃PO₄－柠檬酸－NaOH缓冲液中，由于柠檬酸对Co²⁺有较强的络合能力，消弱了Co²⁺与四环素的络合。故本实验选择Na₂HPO₄－NaOH作为缓冲溶液。

2.1.4  钴离子用量的影响  在Na₂HPO₄－NaOH缓冲液中，足够量的Co²⁺对对络合物的形成是必要的，随钴离子用量的增加，络合物的吸光度了相就增加。钴离子用量在1.5－3.0ml范围内，吸光度值最大且稳定。故本验选择钴离子的用量为2ml。

2.1.5 温度及时间对形成络合物的影响  温度升高，吸光度略有减小，同时，随温度升高，络合物的最大吸收波长会发生红移，故本研究选择在室温（20℃）下进行。另外，实验还表明，络合物的形成速度比较快，按实验方法加入试剂后（约需10min），立刻进行时间扫描，发现1h内络合物的吸光度值的变化仅为0.005，24h内吸光度值无显著变化，说明生成的络合物很稳定。

2.1.6  线性范围  在12支25ml的比色管中，依次加入 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0，2.5ml盐酸四环素标准工作液各两份，其余按实验方法处理后测定，所得结果线性处理后，线性回归方程为：A＝－0.0095＋0.0305c（c为四环素的浓度：ug／ml），相关系数r＝0.9997，

ε＝1.33×10₄L·mol^－1·cm^－1。

根据IUPAC规定，计算得检出限为0.40ug／ml，结果表明四环素浓度在0.80－

25ug／ml范围内符合比耳定律。

2.2  干扰性实验

四环素制剂中加有淀粉、滑石粉、糊精、葡萄糖、硬脂酸镁等赋形剂。按实验方法作同样处理，所有赋形剂的差示光谱在测定波长处无吸收。因此，可以不用任何分离直接测定片剂中四环素的含量。

2.3   回收率测定

精密称取适量已知含量的样品，加入一定量的盐酸四环素标准品，按实验方法处理，用测得的吸光度值减去样品的吸光度，用线性回归方程计算，结果见表1。

表  1  回收率实验结果

3 样品的测定

精密称取四环素片10片，分别研成粉末，再适量称取，按前述实验方法处理测定，用回归方程计算其含量，结果见表2。本法较紫外法结果略偏低，经t检验，本法与紫外法间并无系统误差。

表2 样品中四环素的测定