紫外分光光度法测蛋白酶活力

紫外分光光度法测蛋白酶酶活力
美析仪器有限公司
关键词：紫外分光光度法；蛋白酶；美析仪器；UV-1700紫外分光光度计
1、原理 
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液 
2.1  三氯乙酸c（CCL3•COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2  氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 按GB601配制。 
2.3  盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 
1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 
2.4  缓冲溶液 
a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶 
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶 
甲液  称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液  称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 
使用溶液  取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶 
甲液  称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液  称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 
使用溶液  取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。 
2.5  10g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 
2.6 100ug/mL L－酪氨酸标准溶液 
a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 
b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 
3  仪器和设备 
3.1  恒温水浴40±0.2℃。 
3.2  美析紫外分光光度计UV-1700。 
4  分析步骤 
4.1  求K值 
按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。 管  号 
酪氨酸标准溶液的浓
度 （μg/mL） 
取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积 
mL 
取水的体积 
mL 
吸光值 Abs. 0 0 0 10  1 10 1 9  2 20 2 8  3 30 3 7  4 40 4 6  5 50 
5 
5 
4.2 测定 
吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。 
a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min； 
b、按下列程序操作： 
 试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样） 加酶液2.00 mL 加酶液2.00 mL 40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min 
加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀） 40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时） 加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀） 继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心 于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值 
c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4.2。标准曲线作同样处理。 
5  计算 
在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。 
X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E 
式中：X——样品的酶活力，(u/mL)； 
      A——试样溶液的平均吸光度；       K——吸光常数； 
      8——反应试剂的总体积，mL；       2——吸取酶液2.00mL； 
      1/10——反应时间10min，以1min计；       n——稀释倍数 
      E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数
为0.77）。 
所得结果表示至整数。 6 结果的允许差 
平行试验测定值之差不得超过3％。

关键词：紫外分光光度法；蛋白酶；美析仪器；UV-1700紫外分光光度计