紫外分光光度计法测定载药纳米纤维毡的药物释放性能

关键词：紫外分光光度计；聚乳酸-羟基乙酸共聚物；美析wwww.macylab.com； 
　　

在中国、美国、英国、日本等不少国家，药物释放度检查实际是指药物固体制剂按照各国药典规定的方法，在一定时间内从固体制剂溶入介质的累计百分率（以被测试剂标示量计算）。释放度是评价药物制剂的质量、固体制剂的生物利用度以及筛选固体制剂工艺、处方和剂型的重要手段[1-2]。药物释放度是随着科学技术和生物药剂学的发展而迅速发展起来的一种新的药品检验方法。现有的释放度测定方法基本上是针对缓释制剂、控释制剂、肠溶制剂及透皮贴剂等药物制剂提出，对目前重点研究的有关载药纤维毡的溶出度测定尚无明确的表述。 
　　载药纤维毡中药物含量相对于药物制剂中载体药物的含量低，对测试所用仪器精度要求较高；载药纤维毡容易漂浮在缓冲溶液中不易浸润，从而难以保证药物有效释放；药物体外释放时需要模拟人体的真实环境（即漏槽条件的确定），一系列的问题导致了现有的试验装置难以较真实地模拟载药纤维毡的药物释放行为。 
　　本研究选择美国食品和药品管理局（FDA）已批准可应用的乳酸（lactic acid）和羟基乙酸（glycolic acid）共聚物[Poly（L-lactide-co-glycolide），PLGA]为原料通过静电纺丝制备纳米纤维毡作为研究对象，以水溶性盐酸四环素（tetracycline hydrochloride，Tet）为模拟药物，详细研究了采用紫外分光光度计法测试和评价PLGA载药纳米纤维在模拟肠液中的体外药物释放行为。 
　　1 试验部分 
　　1.1 试验原料和测试仪器 
　　聚乳酸-羟基乙酸/盐酸四环素（PLGA/Tet）静电纺丝纤维毡由实验室自行制备，三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、浓盐酸、氢氧化钠、磷酸二氢钾、氯化钠等均为分析纯。 
　　所采用的测试设备如下：台式离心机、曲线控制真空干燥箱、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A）、集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S、取液器、电子天平、精密pH计、紫外可见分光光度计、恒温振荡器。 
　　1.2 试验方法与步骤 
　　1.2.1 人工模拟肠液的配制 
　　根据2010年版《中国药典》（二部）附录Ⅳ中D缓冲液的配制方法，配制pH=6.8的磷酸缓冲溶液[以下简称为PBS（pH=6.8）缓冲溶液]作为本试验体外释放的介质。 
　　1.2.2 紫外分光光度计测定波长和最小分辨率的确定 
　　利用紫外可见分光光度计测量药物的含量[3， 6， 11-15]，这一方法的可操作性、灵敏性和重复性是需要考虑的重要因素，吸收波长和最小分辨率的确定直接决定着测试数据的有效性。 
　　（1） 标准曲线的绘制 
　　称取一定量的Tet，置于50mL容量瓶中，用PBS溶液适量振荡使其完全溶解，加PBS溶液溶解并稀释至刻度，作为贮备液。分别从贮备液中量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL置于10mL的容量瓶中，用PBS溶液稀释至刻度，摇匀，得到系列标准溶液。按照分光光度法[2010年版《中国药典》（二部）附录Ⅳ]，选取360nm为工作波长测定吸光度[9， 16]，以吸光度（A，Abs）对浓度（C，μg/mL）作线性回归，绘制标准曲线y=0.034x+0.002（R2=0.999）。结果表明，Tet在1μg/mL～70μg/mL范围内浓度和吸收度呈良好的线性相关性。 
　　由此表明，在所测质量浓度范围内，溶液的吸光度与质量浓度呈良好的线性关系，具有较高的置信度。 
　　（2） 最小分辨率的确定 
　　由于紫外可见分光光度计仪器的最小分辨率为0.001Abs，最大吸光度为3.000Abs，仪器的读数偏差在±0.004Abs的范围内，根据Tet在PBS缓冲溶液中的标准工作曲线换算得知，仪器对药物存在一个最小分辨率和最佳测试范围的问题，本试验中仪器对Tet的测试范围为0.03μg/mL ～88.24μg/mL。但是由于吸光度和浓度在一定的范围内呈现线性关系，当药物含量低于仪器的最小分辨率时，采用紫外分光光度法测试药物的溶解度存在较大的误差。此时，可以选用其他精确度更高的测试方法，比如高效液相色谱法等[4， 17-18]。而当药物浓度太高时，吸光度与浓度的关系就偏离了线性范围。所以，紫外可见分光光度计测试药物的释放度存在一个最佳测试范围。本试验中，Tet对PBS缓冲溶液的最佳测试范围为1μg/mL～70μg/mL。 
　　1.2.3 纤维毡载药量的测定 
　　本试验条件是模拟人体肠液的环境，故选用人体的温度（37±0.5）℃为溶出介质温度。 
　　采用萃取法测定纳米纤维的载药量。取待测纤维膜10mg，溶解在5mL的三氯甲烷中，加入10mL的PBS溶液，超声振荡，以30min为时间间隔，不同时间取上层清液，高速离心机5000rpm的速度离心6 min后，用紫外分光光度计检测溶液的吸光度。当吸光度不再改变，表示药物已经完全从溶解的三氯甲烷中溶解萃取出来。通过对比标准曲线获得药物的浓度，再通过换算得到纤维膜的载药量。 　

1.2.4 纤维毡药物体外释放度的测定 
　　方法一[4-6， 8-9]：取待测纤维膜10mg，浸入含5mL PBS缓冲溶液的具塞试管中，并将具塞试管放入恒温振荡器中（37℃，120r/min）恒温振荡，于一定时间分别取出纳米纤维膜，同时加入5mL恒温后的相应新鲜缓冲液。按照分光光度法[2010年版《中国药典》（二部）附录Ⅳ]检测待测溶液的吸光度，根据标准曲线求得各取样时间释放液中的药物浓度，计算各取样时间的累计释放量，累积释放量与实际药物含量的比值，即为各取样时间药物的累计释放百分率。药物累计浓度的计算公式为 
　　方法二[3， 7， 20]：体外释放测定之前，先确定药物于37℃时在PBS中的溶解度。称取过量的盐酸四环素药物于一定量的PBS溶液中，在（37±0.5）℃的恒温水浴中搅拌2h待充分溶解，静置24h，取上层清液离心（5000rpm，2min），加入PBS缓冲溶液稀释摇匀后于最大吸收波长处测试溶液的吸光度，根据标准曲线计算其饱和溶解度。 
　　根据溶解度计算出溶解实际载药量的药物所需的介质体积。本试验中，为了与方法一对比，我们固定释放介质体积为10mL，按照漏槽条件反推换算成所需的纳米纤维毡质量（如5%Tet/PLGA/PBS，称取15mg纤维膜；8%Tet/PLGA/PBS，称取10mg纤维膜），浸入含10mLPBS缓冲溶液的25mL锥形瓶中，然后将锥形瓶放入恒温振荡器中（37℃，120rpm），一定时间分别用取液器吸取1mL溶液备测，同时加入1mL恒温后的相应新鲜缓冲液。检测待测溶液的吸光度，根据标准曲线求得各取样时间释放液中的药物浓度，计算各时间的累计释放量，除以实际药物含量，即得各取样时间药物的累计释放率。另外需要对药物浓度校正，校正公式为： 
　　上述所有测试，对每一个样品进行3次平行测定。 
　　2 结果与讨论 
　　2.1 紫外分光光度计法的可行性分析 
　　为了研究紫外分光光度计法的准确性和可行性，我们对同一个载药纤维膜在三处不同的部位取样，利用紫外可见分光光度计测量药物释放度，结果如图1。 
　　从图1可以看出，对同一个纳米纤维毡样品，利用紫外分光光度计3次测量得出的释放曲线整体趋势相似，都是先突释、后缓释，曲线拐点都出现在8h的取样点处。累计释放率存在的偏差，原因主要在于所纺纳米纤维毡各处药物分布并不能达到完全一致，不同取样部位载药量会有一定的差别，但是偏差都在4%以内。另外，当药物释放一定时间之后，释药曲线会出现一定程度下降。这可能是因为采用方法二中的公式计算累计释放率时，当某两个取样时间点内药物释放量较小时，释放介质整体的浓度变化较小，从而实际吸光度变化也很小。本试验中所用紫外分光光度计读数偏差在±0.004的范围内。将这一微小的偏差根据标准工作曲线反推得到的浓度也会有一定的偏差，从而使得累计释放率出现下降的趋势。同时，药物释放的后期，纤维膜表面由于药物释放溶解后形成的纳米微孔，导致纤维毡有一定的降解和药物的反吸附。故当药物浓度低于仪器的测量精确度时，为了得到更加准确的结果，可以考虑精确度更高的测试方法，比如高效液相色谱法等。 
　　对于同一样品，不同测试日期，测试载药纤维毡药物释放性能，其结果如图2所示。由图可见，不同测试日期，载药纤维毡表现出一致的药物释放趋势。这些结果充分说明本试验采用紫外分光光度计法的可行性。 
　　2.2 漏槽条件对纤维毡缓释性能的影响 
　　释放介质的体积应符合漏槽条件。漏槽状态即药物所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度。漏槽状态的生理学解释为：药物在体内被迅速吸收，制剂的体外包括释放度等测定需要模仿体内生理条件的，满足药物溶解—吸收的过程。漏槽条件起到了修正作用，一般释放介质的体积为药物饱和溶液所需介质体积的3～7倍。因此需要释药系统在体内处于这样的状态。根据漏槽条件和药物溶解度，调整不同药物含量纤维膜的质量和释放介质的体积，使得实际药物体外释放体系更接近体内生理条件。 
　　本文建立了两种释放度测定方法，方法一未考虑漏槽条件来选择释放介质的体积，只保证药物可完全溶解。方法二严格按照漏槽条件要求确定释放介质体积。两种方法所测得药物释放率如图3所示。从图可以看出，同一时刻，方法二药物的释放率比方法一高达20%。这是因为方法二中释放介质体积远大于药物完全溶解所需的体积。药物从纤维膜上扩散到介质中的速率受浓度梯度和药物溶蚀的影响，释放介质越多，浓度梯度越大，药物的迁移速度越快，释放率越高。当药物在人体内释放时，人体内的肠液或组织液都不是静止状态，会及时带走释放出来的药物。这就相当于介质体积很大，也即漏槽条件是模拟人体内释放环境的一个必要因素。 
　　方法一中，把纤维膜全部取出，药物和缓冲溶液在纤维膜上的残留和损失、量取新鲜溶液的体积误差、纤维膜的铺展程度、操作时间误差及药物在溶液中的溶解度都会影响方法一测试结果的准确性。更重要的是，方法一未考虑药物在体外释放体系的溶解度和漏槽条件，不能更好地模拟人体体外释放的真实条件。调整后的测试药物释放方法（方法二）比之前把纤维膜取出、完全更换缓冲液的方法（方法一）更接近药物体外释放的情况，特别对于纤维膜容易降解（逐渐转变为碎片和纤维膜在缓冲溶液中逐渐腐烂）的情况，方法二更准确。