和脂肪中的〔多不饱和〕脂肪酸油和脂肪 分光光度法
发布日期：2017-12-27 点击次数：
A 原理
天然共轭化合物可通过在纯的溶剂中测定特定波长下的吸收加以检测。非共轭多不饱和组份可通过在KOH－甘醇溶液中加热而使其发生部分共轭，共轭部分的吸收可重新测定。共轭双烯，三烯，四烯和五烯酸的百分数(%)可通过预先测定吸光系数，用解联立方程计算得到。$$此方法可通过五烯酸而测定多不饱和脂肪酸，双烯酸，对于仅含天然的或顺式异物体动物和植物脂肪，仅有小量的成形共轭物质，也只有少量色素的吸收在碱性异构化时可以发生很大的改变。此方法便不适应或在特定的条件下才可使用，如氢化油或其它含有反式或不饱和脂肪酸异构体的脂肪，类似的鱼油或含有比五烯酸更不饱和的酸的脂肪，原油或含有碱性异构化时其吸收值发生很大变化的色素的样品，含有大量成形共轭脂肪酸的脂肪或油。
B 仪器
B.a 异构化仪器
B.a.1 恒温浴
180±1℃。其容量应可使25×250mm派热克斯玻璃试管浸入114mm，以B－219石蜡或DC 550液作为浴液。将浴器放在绝热盒中，其中绝热盒盖上应有搅拌器和放试管的孔。
B.a.2 试管
派热克斯玻璃，带嘴，25×250mm。
B.a.3 分散头
能与试管配套。分散头为两端开口的中空管，且距离底部25和38mm处有两个小孔。
B.a.4 多支管
有10个出口，每个出口与50mm长口径为1mm的毛细管相连接。不用时应盖住口。
B.a.5 氮气测压计
由外径为6mm的管子弯成高约380mm，宽约30mm的U－型管。用含有1滴甲黄橙和1滴H2SO4的水使测压计半充满。为了调节氮气的流速，可用长约90cm的橡皮管连接到分散头的出口。将100ml的量筒充满水并将其倒放在一含有水的容器中。将橡皮管的一端插到量筒中。打开氮气瓶，测定氮气排出量筒中水的速度。此速度应在50－60ml/min。在测压计上标明此流速的相应液位。
B.b 分光光度计
波长范围应为220－360nm，最小刻度为0.1nm。当光路中无比色皿时调节氢灯，这样光度计可在最低可能的波长下进行平衡调节〔波长通常小于等于211nm〕。在262，268和274nm进行吸收测定时狭缝宽度非常重要，最后平衡调节应为0.8－0.9mm。
B.c 比色皿
石英、配对的比色皿光程在1.000±0.005cm之内，当充有水或异辛烷时，其吸光度应在0.01A单位内相匹配。
C 试剂
C.a 无水甲醇
光程为1cm时以水作参比在220nm和测定所用波长范围检查甲醇的A值。在220nm时，其值应小于0.4，在262－322nm范围内A的改变曲线应光滑。否则按下述方法纯化甲醇，重新检查A值：以新启桶或玻璃瓶中取2L甲醇于3L双颈标准磨口蒸馏瓶中；加入10gKOH和25g锌粉，塞住其中的一个口，在另一口上接上回流冷凝器，蒸气浴上回流3h。从蒸气浴上取下；将回流冷凝器换成蒸馏管，75℃连接管和冷凝器。将烧瓶放在水浴或电热袍上进行蒸馏。用2L的锥形瓶收集馏出液。存放于具塞玻璃瓶中。较高纯度的无水甲醇〔如上述所得或经纯化〕可满足要求。
C.b 异辛烷〔2，2，4-三甲基戊烷〕
NIST鉴定纯或光谱纯。符合A值要求的正已烷或环已烷可满足要求。可按下述步骤进行纯化：在80×4.5cm过滤管底部的活塞上端放约9cm的玻璃棉。加入约30cm硅胶〔粒度为12，28－200目，将异辛烷缓慢加入管中，使达约3/4处。用包有Al箔的软木塞很松地塞住管的顶端并让异辛烷从硅胶中滤过，用2L的锥形瓶进行收集。为了使异辛烷产生最低限的A值，可及时更换硅胶。以水作参比，用1cm光程在测试波长范围检查异辛烷的A值。在所有波长下，以水的A值为0时，异辛烷的A值应小于等于0.070，且A随波长的改变曲线为一光滑的曲线。否则要重新过滤且重新进行检查。
C.c KOH-甘醇溶液
6.6%KOH，异构化25min。称取约750g的甘醇到1L圆底派热克斯玻璃烧瓶中。用装有短的出口管而进口管可到达烧瓶底部的带管塞子盖住烧瓶。将进口管与无氧的氮气源相连接〔氧含量<0.01%〕，在整个制备过程中向液体中慢慢鼓氮气使排出所有空气和搅动液体。将其放置在100－150℃的油浴中；使油浴升温到190℃并持续10min以干燥甘醇。撒除油浴使其温度降至120℃，在氦气氛下小心缓慢地向溶液中加入60g 85%的KOH。重新放回油浴，再次加热油浴到190℃，并持续此温度10min之后，从油浴上撒离，冷却。取下带有管塞子换上实心塞子盖上，氮气氛中在约4℃〔40℉〕冰箱中保存。$$将10.00gKOH－甘醇溶液加到约90ml甲醇中，以酚酞作指示剂用1N的HCl进行中和以检查KOH的含量。用1N的标准HCl进行滴定至浅红色消失。%KOH＝ml×当量浓度×5.61/溶液重量。如果%KOH不是6.5－6.6，按上述方法在氮气氛下加热至190℃使甘醇再干燥一些，调节KOH到6.6%。
C.d KOH－甘醇溶液
21%KOH，异构化15min。按(c)方法制备，其中85%KOH用量为210g。如需要时，滴定测量并调节KOH的含量为21±0.1%。
C.e 氮气
预纯化级，氧含量<0.01%。
D 样品的制备
在蒸气浴上小心使样品熔化，充分搅拌，不澄清时可过滤。
E 测定
(当样品中仅含亚油酸和亚麻酸时，最好采用6.6%KOH法；当样品含有亚油酸，亚麻酸和花生四烯酸时，最好采用21%KOH法。当样品含有戊烯酸时，必需采用21%KOH法〕。
E.a 共轭多不饱和酸
向1ml的派热克斯玻璃杯〔直径14mm，高10mm〕中称取足够量的样品使其A值读数大于等于0.2〔约200mg〕。将此杯投入含有75ml异辛烷的150ml烧杯中，旋转烧杯使样品溶解，必要时可加热。冷却至室温，转移到100ml的具塞容量瓶中，用溶剂稀释到刻线，充分混匀。以溶剂作参比在UV区测定A值，稀释溶液〔如需要时和/或采用其它光程的比色皿以使所测A值在0.2－0.8范围内〕。同时在特定波长的两边读数，以确定最大A值的存在。如果在特定波长区无最大值，则可认为组份不存在，因此在此范围可无需进行进一步计算。所对应的测定波长为：二烯酸，233nm；三烯酸，262，268，274nm；四烯酸，308，315，322nm；五烯酸，346nm。
E.b 非共轭多不饱和脂肪酸，6.6%KOH，异构化25min
向1ml的派热克斯玻璃杯〔直径14mm，高10mm〕中称取足够量的样品使其A值读数大于等于0.2〔约200mg〕。将此杯投入含有75ml异辛烷的150ml烧杯中，旋转烧杯使样品溶解，必要时可加热。冷却至室温，转移到100ml的具塞容量瓶中，用溶剂稀释到刻线，充分混匀。以溶剂作参比在UV区测定A值，稀释溶液〔如需要时和/或采用其它光程的比色皿以使所测A值在0.2－0.8范围内〕。同时在特定波长的两边读数，以确定最大A值的存在。如果在特定波长区无最大值，则可认为组份不存在，因此在此范围可无需进行进一步计算。所对应的测定波长为：二烯酸，233nm；三烯酸，262，268，274nm；四烯酸，308，315，322nm；五烯酸，346nm。
E.c 非共轭多不饱和脂肪酸，21%KOH，异构化15min
称取100mg〔精确到0.5mg)样品到1ml派热克斯玻璃杯中。称取11.0±0.1g的6.6%KOH－甘醇溶液到25×250mm派热克斯玻璃试管中。在样品测定的同时做二个空白对照。用分散头盖住试管，将毛细管与多支管相连。调节氮气的流量使每分钟通过试管的氮气流量为大于等于50～100ml。让氮气通过试管1分钟以除空气；然后在180±0.1度将试管浸入浴面下114mm处。随时检查温度，定期校正温度计。$$20min后取下分散头，将装有样品的1ml杯子投入试管中，准确记录时间，更换头。投入1ml干净的杯子做为空白。保持分散头在原处，从浴器中移出试管，剧烈回荡几秒钟，放回浴器；1min后，检查样品。如果澄清则放回浴器；否则表明皂化不完全，将试管回荡2－3次后放回浴器。每隔1min重复回荡直到皂化完全。保持浴器温度在180±1℃。$$在将样品投入试管中整好25min后，从浴器中取出，擦干净后放入3L烧杯中冷却，继续在溶液上面通氮气。也可用冷水浴。冷却后取掉头，用20ml经纯化的甲醇洗涤管子下部，收集洗涤液于试管中。用烧杯中的甲醇洗涤，不要用洗瓶。$$将一端弯曲的长30cm的玻璃搅拌棒插入到试管的底部，上下来回移动杯子以混合溶液。将此溶液转移到100ml的具塞容量瓶中，用经纯化的甲醇稀释到刻线，充分混匀。以KOH－甘醇空白作参比按(a)测定A值。如果样品需要稀释时，也应对参比做同样的稀释。如果不检测空白，应重复测定数次，增加氮气流量。
F 分光光度读数
如果已知样品中不含多不饱和脂肪酸，或在测试中已确证其不存在〔在分析波长下无最大值〕，则在此吸收范围内无需有分光光度读数，此范围内计算式中不需要a值。例如，已知棉籽中不含有比二烯酸〔亚油酸〕具有更大不饱和度的多不饱和组份，因此，在分析此油时，只需在233nm进行测定，且计算亚油酸含量的方法中仅需在此滤长下的α值。$$只有在测定非常少量脂肪酸时，才需对背景吸收进行校正。如果脂肪酸的含量较多时，无需进行背景校正，且校正可能会得出错误的结果。在分析波长下，当多不饱和组份在异构化后的α值>1.0时，无需进行背景校正。在用21%KOH进行异构化后，无需对背景进行校正。
F.a 共轭组份的吸光系数
计算每一测定波长下的α值，E(a)，用233，268，315，346下角注以标明所对应的每个α值。$$吸收系数α＝A/bc，式中A为所测的吸光度，b为比色皿光程〔cm〕，c为在测A时的样品最终稀释度，g样品/L。$$以下带有2，3，4和5下标注的计算式，分别对应于二烯，三烯，四烯和五烯的组份。$$在233nm处经酸或酯基吸收校正的吸收系数二α2＝α233－α0，式中α0对于酯，其值为0.07，对于皂和脂肪酸，其值为0.03。$$在268nm处经背景吸收校正后的吸收系数＝α3＝2.8[α268－1/2(α262+α274)]。$$在315nm处经背景吸收校正后的吸收系数＝α4＝2.5[α315－1/2(α308+α322)]。$$在346nm处的吸收系数＝α5＝α346。
F.b 共轭酸
如果在α3或α4括号中的值为0或负值，则表明没有最大特征吸收，认为所对应的组份不存在。由于前体组份通常含量较少，因此需要进行背景吸收校正。如果前体组份大量存在时，此方法则不适应。然而，在戊烯区，346nm，读数可不需进行背景校正。$$%共轭二烯＝C2＝0.91α2$$%共轭三烯＝C3＝0.47α3$$%共轭四烯＝C4＝0.45α4$$%共扼戊烯＝C5＝0.39α5
F.c 非共轭组份吸收系数，6.6%KOH，异构化25min
在每一测定波长下计算α'值，(b)，α'＝A/bc。$$经对原来存在的共轭二烯酸进行校正后，在233nm处的吸收系数＝α'2＝α'233－α2－0.03。$$经对背景吸收及未被破坏的共轭三烯进行校正后在268nm处的吸收系数＝α'3＝4.03[α'268－1/2(α'262+α'274)]－α3。$$经对背景吸收及未被破坏的共轭四烯进行校正后在315nm处的吸收系数＝α'4＝2.06[α'315－1/2(α'308+α'322)]－α4。
F.d 非共轭酸，6.6%KOH，异构化25min
F.d.1 未经背景校正：
%亚油酸＝X＝1.086α'2－1.324(α'268－α268)+0.40(α'315－α315)$$%亚麻酸＝Y＝1.980(α'268－α268)－4.92(α'315－α315)$$%花生四烯酸＝Z＝4.69(α'315－α315)
F.d.2 当需要进行背景校正时：
%亚油酸＝X＝1.086α'2－1.324α'3+0.40α'4$$%亚麻酸＝Y＝1.980α'3－4.92α'4$$%花生四烯酸＝Z＝4.69α'4
F.e 非共轭组份的吸收系数，21%的KOH，异构化15min
计算233，268，315和346nm下每一波长的α'值。〔如果无最大值，无需进行进一步测定或计算，报告组份含量为0〕。$$在233nm处的吸收系数＝α'2＝α'233－α2$$在268nm处的吸收系数＝α'3＝α'268－α268$$在315nm处的吸收系数＝α'4＝α'315－α315$$在346nm处的吸收系数＝α'5＝α'346－α346
F.f 非共轭酸，21%的KOH，异构化15min
〔分光光度法将不能区分不同链长具有相同数目双键的酸，如不能区分C20和C22戊烯酸。下列计算式中的前两组分别适用于含有C20戊烯酸的样品和含有C22戊烯酸的样品。如果不知道链长，假设这些戊烯酸的含量相等，则采用第三组计算式〕
F.f.1 含有C20戊烯酸的样品：
%亚油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4+0.002α'5$$%亚麻酸＝Y＝1.10α'3－0.88α'4+0.31α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.55α'5$$%戊烯酸＝P＝1.14α'5
F.f.2 含有C22戊烯酸的样品：
%亚油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4－0.12α'5$$%亚麻酸＝Y＝1.10α'3－0.88α'4－0.02α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.86α'5$$%戊烯酸＝P＝1.98α'5
F.f.3 含未知链长戊烯酸的样品〔按50%C20－50%C22戊烯酸计算〕：
%亚油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4－0.03α'5$$%亚麻酸＝Y＝1.10α'3－0.88α'4+0.19α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.67α'5$$%戊烯酸＝P＝1.45α'5
F.g 总组成：
%总共轭多不饱和酸＝C2+C3+C4+C5$$%总非共轭多不饱和酸＝X+Y+Z+P$$%油酸＝{样品的碘值(wijs)－[1.811(C2+X)+2.737(C3+Y)+3.337(C4+Z)+ 4.014(C5+P)]}/0.899$$%饱和酸＝%总脂肪酸－(%油酸+%共轭酸+%非共轭酸)$$〔许多天然油的%总脂肪酸为95.6。将%值乘以100/%总脂肪酸即为脂肪酸组份〕。
G 计算
天然共轭化合物可通过在纯的溶剂中测定特定波长下的吸收加以检测。非共轭多不饱和组份可通过在KOH－甘醇溶液中加热而使其发生部分共轭，共轭部分的吸收可重新测定。共轭双烯，三烯，四烯和五烯酸的百分数(%)可通过预先测定吸光系数，用解联立方程计算得到。$$此方法可通过五烯酸而测定多不饱和脂肪酸，双烯酸，对于仅含天然的或顺式异物体动物和植物脂肪，仅有小量的成形共轭物质，也只有少量色素的吸收在碱性异构化时可以发生很大的改变。此方法便不适应或在特定的条件下才可使用，如氢化油或其它含有反式或不饱和脂肪酸异构体的脂肪，类似的鱼油或含有比五烯酸更不饱和的酸的脂肪，原油或含有碱性异构化时其吸收值发生很大变化的色素的样品，含有大量成形共轭脂肪酸的脂肪或油。
B 仪器
B.a 异构化仪器
B.a.1 恒温浴
180±1℃。其容量应可使25×250mm派热克斯玻璃试管浸入114mm，以B－219石蜡或DC 550液作为浴液。将浴器放在绝热盒中，其中绝热盒盖上应有搅拌器和放试管的孔。
B.a.2 试管
派热克斯玻璃，带嘴，25×250mm。
B.a.3 分散头
能与试管配套。分散头为两端开口的中空管，且距离底部25和38mm处有两个小孔。
B.a.4 多支管
有10个出口，每个出口与50mm长口径为1mm的毛细管相连接。不用时应盖住口。
B.a.5 氮气测压计
由外径为6mm的管子弯成高约380mm，宽约30mm的U－型管。用含有1滴甲黄橙和1滴H2SO4的水使测压计半充满。为了调节氮气的流速，可用长约90cm的橡皮管连接到分散头的出口。将100ml的量筒充满水并将其倒放在一含有水的容器中。将橡皮管的一端插到量筒中。打开氮气瓶，测定氮气排出量筒中水的速度。此速度应在50－60ml/min。在测压计上标明此流速的相应液位。
B.b 分光光度计
波长范围应为220－360nm，最小刻度为0.1nm。当光路中无比色皿时调节氢灯，这样光度计可在最低可能的波长下进行平衡调节〔波长通常小于等于211nm〕。在262，268和274nm进行吸收测定时狭缝宽度非常重要，最后平衡调节应为0.8－0.9mm。
B.c 比色皿
石英、配对的比色皿光程在1.000±0.005cm之内，当充有水或异辛烷时，其吸光度应在0.01A单位内相匹配。
C 试剂
C.a 无水甲醇
光程为1cm时以水作参比在220nm和测定所用波长范围检查甲醇的A值。在220nm时，其值应小于0.4，在262－322nm范围内A的改变曲线应光滑。否则按下述方法纯化甲醇，重新检查A值：以新启桶或玻璃瓶中取2L甲醇于3L双颈标准磨口蒸馏瓶中；加入10gKOH和25g锌粉，塞住其中的一个口，在另一口上接上回流冷凝器，蒸气浴上回流3h。从蒸气浴上取下；将回流冷凝器换成蒸馏管，75℃连接管和冷凝器。将烧瓶放在水浴或电热袍上进行蒸馏。用2L的锥形瓶收集馏出液。存放于具塞玻璃瓶中。较高纯度的无水甲醇〔如上述所得或经纯化〕可满足要求。
C.b 异辛烷〔2，2，4-三甲基戊烷〕
NIST鉴定纯或光谱纯。符合A值要求的正已烷或环已烷可满足要求。可按下述步骤进行纯化：在80×4.5cm过滤管底部的活塞上端放约9cm的玻璃棉。加入约30cm硅胶〔粒度为12，28－200目，将异辛烷缓慢加入管中，使达约3/4处。用包有Al箔的软木塞很松地塞住管的顶端并让异辛烷从硅胶中滤过，用2L的锥形瓶进行收集。为了使异辛烷产生最低限的A值，可及时更换硅胶。以水作参比，用1cm光程在测试波长范围检查异辛烷的A值。在所有波长下，以水的A值为0时，异辛烷的A值应小于等于0.070，且A随波长的改变曲线为一光滑的曲线。否则要重新过滤且重新进行检查。
C.c KOH-甘醇溶液
6.6%KOH，异构化25min。称取约750g的甘醇到1L圆底派热克斯玻璃烧瓶中。用装有短的出口管而进口管可到达烧瓶底部的带管塞子盖住烧瓶。将进口管与无氧的氮气源相连接〔氧含量<0.01%〕，在整个制备过程中向液体中慢慢鼓氮气使排出所有空气和搅动液体。将其放置在100－150℃的油浴中；使油浴升温到190℃并持续10min以干燥甘醇。撒除油浴使其温度降至120℃，在氦气氛下小心缓慢地向溶液中加入60g 85%的KOH。重新放回油浴，再次加热油浴到190℃，并持续此温度10min之后，从油浴上撒离，冷却。取下带有管塞子换上实心塞子盖上，氮气氛中在约4℃〔40℉〕冰箱中保存。$$将10.00gKOH－甘醇溶液加到约90ml甲醇中，以酚酞作指示剂用1N的HCl进行中和以检查KOH的含量。用1N的标准HCl进行滴定至浅红色消失。%KOH＝ml×当量浓度×5.61/溶液重量。如果%KOH不是6.5－6.6，按上述方法在氮气氛下加热至190℃使甘醇再干燥一些，调节KOH到6.6%。
C.d KOH－甘醇溶液
21%KOH，异构化15min。按(c)方法制备，其中85%KOH用量为210g。如需要时，滴定测量并调节KOH的含量为21±0.1%。
C.e 氮气
预纯化级，氧含量<0.01%。
D 样品的制备
在蒸气浴上小心使样品熔化，充分搅拌，不澄清时可过滤。
E 测定
(当样品中仅含亚油酸和亚麻酸时，最好采用6.6%KOH法；当样品含有亚油酸，亚麻酸和花生四烯酸时，最好采用21%KOH法。当样品含有戊烯酸时，必需采用21%KOH法〕。
E.a 共轭多不饱和酸
向1ml的派热克斯玻璃杯〔直径14mm，高10mm〕中称取足够量的样品使其A值读数大于等于0.2〔约200mg〕。将此杯投入含有75ml异辛烷的150ml烧杯中，旋转烧杯使样品溶解，必要时可加热。冷却至室温，转移到100ml的具塞容量瓶中，用溶剂稀释到刻线，充分混匀。以溶剂作参比在UV区测定A值，稀释溶液〔如需要时和/或采用其它光程的比色皿以使所测A值在0.2－0.8范围内〕。同时在特定波长的两边读数，以确定最大A值的存在。如果在特定波长区无最大值，则可认为组份不存在，因此在此范围可无需进行进一步计算。所对应的测定波长为：二烯酸，233nm；三烯酸，262，268，274nm；四烯酸，308，315，322nm；五烯酸，346nm。
E.b 非共轭多不饱和脂肪酸，6.6%KOH，异构化25min
向1ml的派热克斯玻璃杯〔直径14mm，高10mm〕中称取足够量的样品使其A值读数大于等于0.2〔约200mg〕。将此杯投入含有75ml异辛烷的150ml烧杯中，旋转烧杯使样品溶解，必要时可加热。冷却至室温，转移到100ml的具塞容量瓶中，用溶剂稀释到刻线，充分混匀。以溶剂作参比在UV区测定A值，稀释溶液〔如需要时和/或采用其它光程的比色皿以使所测A值在0.2－0.8范围内〕。同时在特定波长的两边读数，以确定最大A值的存在。如果在特定波长区无最大值，则可认为组份不存在，因此在此范围可无需进行进一步计算。所对应的测定波长为：二烯酸，233nm；三烯酸，262，268，274nm；四烯酸，308，315，322nm；五烯酸，346nm。
E.c 非共轭多不饱和脂肪酸，21%KOH，异构化15min
称取100mg〔精确到0.5mg)样品到1ml派热克斯玻璃杯中。称取11.0±0.1g的6.6%KOH－甘醇溶液到25×250mm派热克斯玻璃试管中。在样品测定的同时做二个空白对照。用分散头盖住试管，将毛细管与多支管相连。调节氮气的流量使每分钟通过试管的氮气流量为大于等于50～100ml。让氮气通过试管1分钟以除空气；然后在180±0.1度将试管浸入浴面下114mm处。随时检查温度，定期校正温度计。$$20min后取下分散头，将装有样品的1ml杯子投入试管中，准确记录时间，更换头。投入1ml干净的杯子做为空白。保持分散头在原处，从浴器中移出试管，剧烈回荡几秒钟，放回浴器；1min后，检查样品。如果澄清则放回浴器；否则表明皂化不完全，将试管回荡2－3次后放回浴器。每隔1min重复回荡直到皂化完全。保持浴器温度在180±1℃。$$在将样品投入试管中整好25min后，从浴器中取出，擦干净后放入3L烧杯中冷却，继续在溶液上面通氮气。也可用冷水浴。冷却后取掉头，用20ml经纯化的甲醇洗涤管子下部，收集洗涤液于试管中。用烧杯中的甲醇洗涤，不要用洗瓶。$$将一端弯曲的长30cm的玻璃搅拌棒插入到试管的底部，上下来回移动杯子以混合溶液。将此溶液转移到100ml的具塞容量瓶中，用经纯化的甲醇稀释到刻线，充分混匀。以KOH－甘醇空白作参比按(a)测定A值。如果样品需要稀释时，也应对参比做同样的稀释。如果不检测空白，应重复测定数次，增加氮气流量。
F 分光光度读数
如果已知样品中不含多不饱和脂肪酸，或在测试中已确证其不存在〔在分析波长下无最大值〕，则在此吸收范围内无需有分光光度读数，此范围内计算式中不需要a值。例如，已知棉籽中不含有比二烯酸〔亚油酸〕具有更大不饱和度的多不饱和组份，因此，在分析此油时，只需在233nm进行测定，且计算亚油酸含量的方法中仅需在此滤长下的α值。$$只有在测定非常少量脂肪酸时，才需对背景吸收进行校正。如果脂肪酸的含量较多时，无需进行背景校正，且校正可能会得出错误的结果。在分析波长下，当多不饱和组份在异构化后的α值>1.0时，无需进行背景校正。在用21%KOH进行异构化后，无需对背景进行校正。
F.a 共轭组份的吸光系数
计算每一测定波长下的α值，E(a)，用233，268，315，346下角注以标明所对应的每个α值。$$吸收系数α＝A/bc，式中A为所测的吸光度，b为比色皿光程〔cm〕，c为在测A时的样品最终稀释度，g样品/L。$$以下带有2，3，4和5下标注的计算式，分别对应于二烯，三烯，四烯和五烯的组份。$$在233nm处经酸或酯基吸收校正的吸收系数二α2＝α233－α0，式中α0对于酯，其值为0.07，对于皂和脂肪酸，其值为0.03。$$在268nm处经背景吸收校正后的吸收系数＝α3＝2.8[α268－1/2(α262+α274)]。$$在315nm处经背景吸收校正后的吸收系数＝α4＝2.5[α315－1/2(α308+α322)]。$$在346nm处的吸收系数＝α5＝α346。
F.b 共轭酸
如果在α3或α4括号中的值为0或负值，则表明没有最大特征吸收，认为所对应的组份不存在。由于前体组份通常含量较少，因此需要进行背景吸收校正。如果前体组份大量存在时，此方法则不适应。然而，在戊烯区，346nm，读数可不需进行背景校正。$$%共轭二烯＝C2＝0.91α2$$%共轭三烯＝C3＝0.47α3$$%共轭四烯＝C4＝0.45α4$$%共扼戊烯＝C5＝0.39α5
F.c 非共轭组份吸收系数，6.6%KOH，异构化25min
在每一测定波长下计算α'值，(b)，α'＝A/bc。$$经对原来存在的共轭二烯酸进行校正后，在233nm处的吸收系数＝α'2＝α'233－α2－0.03。$$经对背景吸收及未被破坏的共轭三烯进行校正后在268nm处的吸收系数＝α'3＝4.03[α'268－1/2(α'262+α'274)]－α3。$$经对背景吸收及未被破坏的共轭四烯进行校正后在315nm处的吸收系数＝α'4＝2.06[α'315－1/2(α'308+α'322)]－α4。
F.d 非共轭酸，6.6%KOH，异构化25min
F.d.1 未经背景校正：
%亚油酸＝X＝1.086α'2－1.324(α'268－α268)+0.40(α'315－α315)$$%亚麻酸＝Y＝1.980(α'268－α268)－4.92(α'315－α315)$$%花生四烯酸＝Z＝4.69(α'315－α315)
F.d.2 当需要进行背景校正时：
%亚油酸＝X＝1.086α'2－1.324α'3+0.40α'4$$%亚麻酸＝Y＝1.980α'3－4.92α'4$$%花生四烯酸＝Z＝4.69α'4
F.e 非共轭组份的吸收系数，21%的KOH，异构化15min
计算233，268，315和346nm下每一波长的α'值。〔如果无最大值，无需进行进一步测定或计算，报告组份含量为0〕。$$在233nm处的吸收系数＝α'2＝α'233－α2$$在268nm处的吸收系数＝α'3＝α'268－α268$$在315nm处的吸收系数＝α'4＝α'315－α315$$在346nm处的吸收系数＝α'5＝α'346－α346
F.f 非共轭酸，21%的KOH，异构化15min
〔分光光度法将不能区分不同链长具有相同数目双键的酸，如不能区分C20和C22戊烯酸。下列计算式中的前两组分别适用于含有C20戊烯酸的样品和含有C22戊烯酸的样品。如果不知道链长，假设这些戊烯酸的含量相等，则采用第三组计算式〕
F.f.1 含有C20戊烯酸的样品：
%亚油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4+0.002α'5$$%亚麻酸＝Y＝1.10α'3－0.88α'4+0.31α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.55α'5$$%戊烯酸＝P＝1.14α'5
F.f.2 含有C22戊烯酸的样品：
%亚油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4－0.12α'5$$%亚麻酸＝Y＝1.10α'3－0.88α'4－0.02α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.86α'5$$%戊烯酸＝P＝1.98α'5
F.f.3 含未知链长戊烯酸的样品〔按50%C20－50%C22戊烯酸计算〕：
%亚油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4－0.03α'5$$%亚麻酸＝Y＝1.10α'3－0.88α'4+0.19α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.67α'5$$%戊烯酸＝P＝1.45α'5
F.g 总组成：
%总共轭多不饱和酸＝C2+C3+C4+C5$$%总非共轭多不饱和酸＝X+Y+Z+P$$%油酸＝{样品的碘值(wijs)－[1.811(C2+X)+2.737(C3+Y)+3.337(C4+Z)+ 4.014(C5+P)]}/0.899$$%饱和酸＝%总脂肪酸－(%油酸+%共轭酸+%非共轭酸)$$〔许多天然油的%总脂肪酸为95.6。将%值乘以100/%总脂肪酸即为脂肪酸组份〕。
G 计算
