分光光度法检测葡萄酒中花青素方法可行性分析
关键词:分光光度法;葡萄酒;花青素；紫外可见分光光度计；美析集团（macylab.com）
一、引言
花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素,属于黄酮类化合物,结构中母核为2-苯基苯并吡喃,是葡萄酒中主要的呈色物质。植物中的花青素常与单糖结合形成花色苷,葡萄酒中花青素以花色苷的形式存在。葡萄酒中主要含有4种花青素:飞燕草色素、矢车菊色素、芍药色素和锦葵色素。目前葡萄酒中花青素的检测方法有液相色谱法、pH示差分光光度法、分光光度法等。由于液相色谱法的标准品比较昂贵,且花青素标准品不稳定,因此限制了该方法的广泛使用。本研究通过分析标准品和样品的全波长扫描图,确定分光光度法的最佳检测波长;通过检测不同储存时间标准品吸光值,分析标准品稳定性,优化标准品储备液最佳使用时间;通过检测加标回收率、检出限、定量限等参数,同时与液相色谱法的数据作对比,分析该方法的稳定性和准确性,对分光光度法检测葡萄酒中花青素方法的可行性进行分析。
二、材料与方法
2.1材料、试剂与仪器
实验用葡萄酒为市售瓶装葡萄酒。
飞燕草色素(纯度98%)、矢车菊色素(纯度98.3%)、芍药色素(纯度98%)、锦葵色素(纯度97%);矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品(纯度98.43%);盐酸(优级纯)、亚硫酸钠(优级纯)、柠檬酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯);无水乙醇、甲醇、甲酸(色谱纯)。
液相色谱仪(带二级管阵列检测器)；
电位滴定仪;
数显恒温水浴锅;
C18液相色谱柱(柱长250mm,内径4.6mm)
2.2实验方法
2.2.1分光光度法检测葡萄酒中花青素
用0.1mol/L柠檬酸水溶液溶解配制矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品母液,浓度为200μg/mL;
标准曲线溶液配制:用0.1mol/L柠檬酸水溶液将标准品母液分别稀释成浓度为1、2、4、8、16、20μg/mL的标准曲线溶液;
空白试剂:量取5mL0.1mol/L柠檬酸水溶液于10mL比色管中,加入0.5mL10%亚硫酸钠溶液,用0.1mol/L柠檬酸水溶液稀释至10mL。以试剂空白调零,在波长518nm处测吸光值,并绘制标准曲线。量取2mL样品于50mL容量瓶中,加0.1mol/L柠檬酸水溶液稀释并定容,静置10min。取7mL上述样品溶液于10mL比色管中,加入2mL10%亚硫酸钠溶液,用0.1mol/L柠檬酸水溶液稀释并定容至10mL,在波长518nm处测定吸光值。将样品吸光值带入标准曲线中,计算样品花青素含量。
2.2.2加标回收实验
向2mL样品中分别加入浓度为200μg/mL标准品母液0.4、0.8、1.2mL,加标水平分别为4、8、12mg/100mL。
每个水平做6次平行。
2.2.3检出限及定量限
测11次样品空白溶液的吸光值,按GB/T5009.1-2003《食品卫生检验方法理化部分总则》的方法计算检出限及定量限。
2.2.4pH值对标准品及样品溶液吸光值的影响
分别测量标准曲线溶液和样品溶液的pH值。配制5份8μg/mL的标准溶液,用0.4mol/L的氢氧化钠分别将5份标准溶液的pH调到1.98、2.00、2.04、2.07、2.13、2.20并测量吸光值。
2.2.5标准品母液的稳定性
分别于标准品母液配制完成后第0、1、2、3、4、5、6d测定标准品吸光值,每次测定之前将母液稀释为浓度为8μg/mL的标准品使用液,现用现配。
2.2.6液相色谱法测定葡萄酒中4种花青素
用10%盐酸-甲醇溶液(V:V)配制飞燕草色素、矢车菊色素、芍药色素和锦葵色素的混标母液,浓度为50μg/mL,用10%盐酸甲醇溶液将混标母液分别稀释成浓度为0.5、1、5、10、25、50μg/mL的标准曲线溶液,过0.45μm滤膜后用液相色谱分析。
量取5mL样品于50mL水解管中,加入20mL乙醇水-盐酸(2:1:1,V:V:V)溶液,摇匀后于沸水浴中水解1h,取出冷却后用乙醇-水-盐酸(2:1:1,V:V:V)溶液定容至25mL。过0.45μm滤膜后用液相色谱分析。液相色谱仪器条件参照NY/T2640-2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》。
三、结果与分析
3.1方法检测波长的选定使用分光光度计分析葡萄酒中的花青素含量。由图1可见矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的最大吸收波长为512nm;由图2可见样品的最大吸收波长为522nm。因此将检测波长定为518nm。样品和标准品最大吸收波长有偏差,是因为葡萄酒中呈色物质为花色苷的混合物，而且除了花色苷外还含有其他呈色物质。因此要通过扣除样品空白来排除其他呈色物质的影响,样品空白中加入亚硫酸钠是为了去除样品中的花青素,亚硫酸钠可以和花青素反应,生成无色化合物,使花青素在518nm附近的特征吸收消失。加入亚硫酸钠后样品空白溶液仍然有颜色,这些颜色主要来源于其他呈色物质。
3.2花青素中pH对吸光值的影响
花色苷的结构会随着pH值的改变而变化,溶液pH不同,花色苷的存在形式也不同。花色苷在溶液中以4种结构存在:蓝色的醌式碱、红色的花烊正离子、无色的甲醇假碱和查尔酮。同一pH时可使这4种结构的化合物比例达到平衡。花色苷在pH值较低时,溶液的颜色为较深的红色。随着pH值的增加花色苷的颜色逐渐变浅,最终将变为无色。因此在使用分光光度法时需要考虑pH对花色苷吸光值的影响,标准曲线溶液和样品溶液的pH值偏差不能太大。表1为标准曲线溶液和样品溶液的pH值,由表1可以看出,样品和标准品的pH值差异不显著(P>0.05),表2为pH值对标准溶液吸光值的影响,由表2可以看出,随着溶液pH的增加,标准品的吸光值显著降低。但是pH为1.98、2.00和2.04时吸光值差异不显著(P>0.05),用柠檬酸溶液提取后样品pH小于2.07,因此样品溶液pH值对吸光值影响较小。与毛建霏等的研究结果一致。柠檬酸具有增色和护色作用,有利于花青素类色素的稳定性,且柠檬酸水溶液对pH的缓冲效果较好。因此本研究选择使用0.1mol/L柠檬酸水溶液平衡样品及标准曲线溶液的pH值。
3.3方法的检出限、定量限及标准曲线
按照GB/T5009.1-2003的方法,测定11次样品空白溶液的吸光值,计算检出限及定量限。得出分光光度法检测花青素的检出限为0.188mg/100mL,定量限为0.625mg/100mL。葡萄酒样品中花青素含量范围约为1.2~8.1mg/100mL,方法定量限可以满足检测要求。图3为花青素标准曲线,检测波长为518nm,标准曲线线性范围为1~20μg/mL,线性较好,r2为0.9998,和毛建霏等研究结果一致。
3.4方法的加标回收率
为了验证分光光度法的准确性,本研究分析了花青素的加标回收率。葡萄酒样品中花青素含量为(6.58±0.38)mg/100mL,根据样品中花青素的含量,选择3个加标水平做回收率实验,加标水平分别为4、8、12mg/100mL,表3为分光光度法花青素的加标回收率。GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中规定待测物质含量为1~100mg/kg时,加标回收率范围要求在90%~110%之间。分光光度法检测葡萄酒中花青素的加标回收率符合GB/T27404-2008的要求。
3.5矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的稳定性分析
本研究分析了1周内矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品母液的稳定性。表4为储存时间对标准品溶液吸光度的影响。由表4可以看出,在标准品配制后的1d和2d与0d时比较,标准品的吸光度大于99%,储存时间为1d和2d时标准品母液的稳定性较高;储存时间大于3d时标准品吸光值发生显著下降,储存3d时标准品的吸光度降低至95.7%±0.1%,储存6d时下降至93.2%±0.1%。由此可见,标准品母液的储存时间为2d,超过2d时标准品溶液将发生降解。
3.6分光光度计法与液相色谱法检测花青素的结果对比
为了验证分光光度法测定花青素含量的准确性,本研究同时使用液相色谱法分析葡萄酒样品的花青素。葡萄酒中主要含有4种花青素:飞燕草色素、矢车菊色素、芍药色素和锦葵色素。表5为葡萄酒样品中4种花青素的含量,由表5可以看出,葡萄酒中飞燕草色素含量最高,其次是矢车菊色素。分光光度计法和液相色谱法测定样品中花青素总量分别为(6.58±0.38)mg/100mL和(6.84±0.021)mg/100mL,两者相对偏差为3.87%,由此可见分光光度法的数据准确度较好。
四、结论
本研究采用分光光度法分析葡萄酒中的花青素含量,葡萄酒样品中花青素含量为(6.58±0.38)mg/100mL,该结果与液相色谱法检测结果差异较小。分光光度法以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标准品,对标准品储备液的稳定性进行分析,确定了标准品储备液最佳使用期限。根据标准品及样品的最大吸收波长,将检测波长定为518nm。样品检测之前应该先用经亚硫酸钠溶液处理过的样品溶液调零,消除样品中其他呈色物质的影响。对标准品和样品进行稀释时,柠檬酸水溶液对pH的缓冲效果较好,可以使标准品和样品溶液的pH保持一致,不会因为pH差异较大影响花青素吸光值。通过对回收率的分析得出,该方法的准确性较好,花青素标准曲线的线性较好,且定量限可以满足葡萄酒中花青素含量的检测。分光光度法适合用于葡萄酒中花青素含量的检测。
五、文献出处及鸣谢
本文主要内容部分出自：1.分光光度法检测葡萄酒中花青素方法可行性分析
纪鹏飞1,张强2,宋俊男1,王希平1*,孙令超3,王芳1*
中图分类号:DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2020.23.068
感谢以上科研工作者的成果分享与交流！
