多条件在线光度法测定桑葚色素稳定性
关键词 分光光度法；在线测量；实时动力学；桑葚色素；稳定性；美析集团（www.macylab.com）
天然色素具有安全性高、营养丰富、色调自然等优点，在消费市场具有极高的认可度，目前已建立多种色素检测分析方法。桑葚富含花色苷类化合物，色彩鲜艳，色价高，以其为原料提取的色素，可广泛应用于高端食品、日用品、化妆品和药品等领域。近年来的研究表明天然色素具有一定的生理活性，具有巨大的开发利用潜力。
桑葚成熟期气温高，成熟集中、果期短，采摘不便，贮存困难，易造成巨大浪费和环境污染。开展桑葚色素高值化利用研究，拓展利用途径，提高产品附加值，对促进农业增收具有重要意义。目前，关于桑葚色素热稳定性的研究较多，但结果差异较大。光、包装材料、氧化剂及添加剂等对桑葚色素稳定性影响的研究较少，且普遍使用定性描述，因此建立桑葚色素稳定性准确、全面的定量描述极为必要。
目前，天然色素稳定性研究中多采用单条件控制、手动离散取样测定方案，劳动强度大，样品容易受到污染，测定准确性较差，不便于考察多种条件如温度、光照、pH 值、氧化、添加剂等对稳定性的影响。本研究开发了一种多条件控制在线光度法实时动力学测定装置，基于该装置采用初始动力学方法测定桑葚色素稳定性。本研究结果为桑葚色素开发利用提供技术支持，为天然色素稳定性研究提供新的测试方法。
1. 材料与方法
1.1 试剂与材料
甲酸、氢氧化钠、乙酸、三水乙酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、过氧化氢、维生素 C（分析纯级），国药集团化学试剂有限公司。
桑葚由宁波鄞州中铭农业科技有限公司提供，成熟果实，外观呈紫黑色。
1.2 设备与仪器
UV-1800 型紫外-可见分光光度计，上海美析仪器有限公司；
冷冻干燥机；
恒温循环器；
低温恒温槽；
pH 计；
磁力搅拌器；
蠕动泵；
5 W 紫外灯（主波长 254 nm）；
日光模拟灯（标识功率 300 W，其中波长 315~400 nm 的辐射功率 13.6 W，波长 280~315 nm 的辐射功率 3.0 W）；
400 μL 流动比色皿；
2 mm 厚石英玻璃、2 mm 厚光学玻璃、1 mm 厚棕色光学玻璃；
0.15 mm 厚 PET 平板。
1.3 试验方法
反应器有效容积 100 mL，连接管路长度约 60 cm，连接管内径 1.6 mm，管路及流动比色皿体积约 1.6 mL。
桑葚果肉水提液过大孔树脂，合并色素洗脱液冷冻干燥，所得粉末为桑葚色素混合物，以缓冲溶液配制桑葚色素储备液。
移取一定量桑葚色素溶液加入反应器，设置控制条件，采集吸光度数据，采样间隔 1 min，总时长 5 h。桑葚色素降解反应速率常数较低，5 h 测定为其初始动力学数据。
2. 结果与分析
2.1多条件在线光度法动力学数据采集装置
如图 1 所示，装置主要由 7 部分组成。反应器为具有色素溶液流入流出接口的夹层烧杯，夹层通入恒温循环水保持体系温度稳定。反应器下方设置有磁力搅拌器，上方设置有光线阻隔材料平板，平板上方为外置光源，反应器内筒中色素溶液在蠕动泵驱动下流经流动比色皿-分光光度计检测器测定后流回循环。
装置管道及比色皿存在一定“死体积”，对反应器内样品施加实时“非全体性”影响时（如光照），理论上存在微小延迟，通过延迟动力学方程可予以消除， -dc / d(t - τ) = kAm ，τ 为“死体积”对应延迟时间（h）。当反应速率常数较低、“死体积”远小于反应器容积、蠕动泵快速循环时，流动比色皿内溶液和反应器内溶液视为等效。
试验装置适用于慢速液体均相动力学过程初始、全程实时数据自动在线采集。测定天然色素褪色动力学时，向反应器内加入色素溶液，设置循环水温度、pH 值、外置光源、光线阻隔材料平板、添加物种类和浓度等一种或多种条件组合，开启搅拌和蠕动泵，分光光度计设置为动力学模式，检测波长为色素溶液最大吸收波长，设置采样间隔，采集数据。温度 20 ℃ ， 以去离子水为参比， 在反应器内加入去离子水循环 1 h ， 吸光度最大差值ΔAmax=0.0021，表明试验装置及测量系统噪音极低，具有良好的稳定性。
2.2 桑葚色素酸碱稳定性
桑葚色素用 pH 值为 3，4，5，6，7，8 的缓冲溶液稀释，在波长 400~800 nm 范围内进行扫描， 结果如图 2 所示，溶液颜色如插图所示，pH 值对桑葚色素颜色影响明显。pH 值为 3 时溶液中桑葚色素呈现纯正红色，鲜艳浓厚，适用于食品、药品、化妆品等产品调色，是桑葚色素最佳酸碱环境，最大吸收波长 514 nm。pH 值从 3 增大为 8 时，对应最大吸收波长红移，红色变浅并逐渐转变为暗红色、红棕色，颜色劣化，感官评价变差。
pH 值为 3 时，以吸光度 A0=0.968 的桑葚色素溶液为储备液，分别移取 0.05，0.1，0.2，0.4， 0.6，0.8 份储备液稀释到 1 份，吸收光谱无变化，稀释曲线线性良好，如图 3 所示。色素降解过程中在波长 514 nm 处监测吸光度的变化。
2.3 桑葚色素热稳定性
在室内自然光照，pH 值为 3，反应体系温度分别为 20~80 ℃，吸光度变化如图 4a 所示。由图 4a可知，20~50 ℃吸光度下降缓慢，20 ℃时桑葚色素吸光度 5 h 仅降低 0.004，主要为系统噪音贡献，60℃开始吸光度降速增加，并随温度升高加剧。对图 4a 吸光度变化进行一次动力学拟合，结果如图4b 所示，拟合反应速率常数及相关系数见图 4a 插表，20 ℃时吸光度变化过小，因噪音掩盖失真， 相关系数低，仅作为参考。30 ℃反应速率常数 k30℃=0.0023 h-1，半衰期 τ30℃=301.4 h，80 ℃反应速率常数 k80℃=0.0492 h-1，半衰期 τ80℃=14.1 h，表明桑葚色素对温度敏感，20 ℃及以下温度冷藏能长期保持颜色稳定，温度过高会加速花色苷破坏。
对不同温度反应速率常数按照阿伦尼乌斯方程 ln(k)=lnA-Ea/(RT)拟合，如图 4b 插图所示，表观活化能 Ea=60.2 kJ/mol，较大的活化能表明桑葚色素降解较为缓慢。温度对色素稳定性影响体现在 2 方面：一方面温度会影响氧化、还原、光解过程反应速率常数，另一方面升高温度使花色苷分子自身热分解更加显著。因此，温度对于色素稳定性极为关键，在生产、贮存、运输、货架等环节注意保持低温。
