分光光度法测叶绿素
发布日期：2017-08-14 点击次数：
一、实验目的
1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。
2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。
二、实验原理
叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：
1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。
2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。
叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。因此测定
提取液在645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a、叶绿素b
和总叶绿素的含量。
三、仪器、原料和试剂
仪器
分光光度计、电子顶载天平(感量0．01g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦境纸、滴管。
原料
新鲜(或烘干)的植物叶片
试剂
1. 96％乙醇(或80％丙酮)
2. 石英砂
3. 碳酸钙粉
四、操作步骤
取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3～5min。
取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL，摇匀。
取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm 和652nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。
五、计算
按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素a、b 和总叶绿素的含量
叶绿体色素的提取、分离、理化性质及含量测定
[ 实验原理 ]
植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。它一般由叶绿素 a 、叶绿素 b 、胡萝卜素和叶黄素组成。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度 D 与其中溶液浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即：
D ＝ KCL
D ：吸光度，即吸收光的量， C ：溶液浓度 ,
K ：为比吸收系数（吸光系数）， L ：液层厚度，通常为 1cm.
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度 D ，并根据叶绿素 a 、 b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
叶绿素 a 、 b 的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于红光区和蓝紫光区，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素 a 、 b 的 80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663nm 和 645nm ，又知在波长 663nm 下，叶绿素 a 、 b 在该溶液中的吸光系数分别为 82.04 和 9.27 ，在波长 645nm 下分别为 16.75 和 45.60 ，可根据加和性原则列出以下关系式：
D 663 ＝ 82.04Ca ＋ 9.27Cb(1)
D 645 ＝ 16.75Ca ＋ 45.60Cb （ 2 ）
式（ 1 ）、（ 2 ）中的 D 663 和 D 645 为叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的吸光度， Ca 、 Cb 分别为叶绿素 a 和 b 的浓度，以 mg ／ L 为单位。
解方程组（ 1 ）、（ 2 ），得：
Ca=12.7D 663 – 2.69 D 645 （ 3 ）
Cb=22.9 D 645 – 4.68D 663 （ 4 ）
将 Ca 与 Cb 相加即得叶绿素总量 Ct ：
Ct=Ca+Cb=20.2 D 645 +8.02 D 663 （ 5 ）
由于叶绿素 a 、 b 在 652nm 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5 ），也可以在此波长下测定一次吸光度（ D 652 ）而求出叶绿素 a 、 b 总量：
Ct= Ca+b=D 652 × 1000/34.5 （ 6 ）
丙酮提取液中类胡萝卜素的含量： Ck=4.7D 440 - 0.27Ca+b
由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。
[ 实验材料 ]
新鲜植物叶片。
[ 仪器设备 ]
研钵，漏斗，滴管，大试管（带胶塞），大头针，滤纸，天平，量筒，毛细管。
试管，试管架，烧杯，酒精灯，玻棒，铁三角架，刻度吸量管，火柴，
分光光度计，容量瓶，定量滤纸。
[ 药品试剂 ]
95 ％乙醇、 80 ％丙酮、石英砂、碳酸钙粉、醋酸铜粉末
推动剂：按石油醚： 乙醚（ 4 ： 1 ）（ V ／ V ）。
KOH- 甲醇溶液： 30gKOH 溶入 100mL 甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。
[ 实验步骤 ]
（一）叶绿体色素的提取
（ 1 ）取植物新鲜叶片 1 克，洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放人研钵中。
（ 2 ）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加 2 ～ 3mL100% 丙酮，研磨至糊状，再加 5mL100 ％丙酮，过滤，即得色素提取液。
（ 3 ）如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片，先用 105 ℃杀青，再在 80 ℃下烘于，研成粉末，密闭贮存。用时称叶干粉 1.5 克放人小烧杯中，加 3mL100% 丙酮浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。
（二）叶绿体色素的分离
• 点样：取前端剪成三角形的滤纸条，用毛细管取叶绿素提取液，如图点样于“色点”处，注意每次所点溶液不可过多，点样后晾干，再重复操作数次。
• 分离：在大试管中加入推动剂，然后将滤纸固定于胶塞的小钩上，插入试管中，使尖端浸入溶剂内（色点要高于叶面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧胶塞，直立于阴暗处层析。
当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，观察色带的分布。叶绿素 a 为蓝绿色，叶绿素 b 为黄绿色，叶黄素为黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。
（三） 将上一个实验中提取的叶绿体色素溶液适当稀释后，进行以下实验：
（ 1 ）荧光现象的观察。
取 l 支试管加入浓的叶绿体色素提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同，可观察到反射出暗红色的荧光。
（ 2 ）氢和铜对叶绿素分子中镁的取代作用
方法一；取两支试管。第一支试管加叶绿体色素提取液 2mL ，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液 2 mL ，再加入 50 ％醋酸数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变竭后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记录溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。
方法二；另取醋酸一醋酸铜溶液 20mL ，置于烧杯中。取新鲜植物叶两片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化。当叶片变褐时，取出一片叶，余下一片继续加热，直至颜色不再变化为止。解释原因。
（ 3 ）皂化作用（绿色素与黄色素的分离）
取叶绿体色素提取液 2 mL 于大试管中，加入 4mL 乙醚，摇匀，再沿试管壁慢慢加人 3 ～ 6mL 蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中，再用蒸馏水冲洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入 30 ％ KOH －甲醇溶液，充分摇匀，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是水溶液，其中溶有皂化的叶绿素 a 和 b ，上层是乙醚溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。将上下层放入两试管中，可供观察吸收光谱用。
（ 4 ）叶绿体色素吸收光谱曲线
将上述叶绿体色素提取液注入 1cm 比色杯中，另取 95% 乙醇作空白，于 400-700nm 之间，每间隔 10nm 读取光密度值。根据测定结果，以波长为横坐标绘制曲线，此即叶绿体色素的吸收光谱曲线。用同样的方法测定皂化作用中分离出绿色素与黄色素的吸收光谱曲线，并对结果进行分析。
（四）叶绿体色素的含量测定
（ 1 ）取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎，混匀。
（ 2 ）称取剪碎的新鲜样品 0.5g ，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及 2 ～ 3mL80 ％丙酮，研成匀浆，再加 80 ％丙酮 5mL ，继续研磨至组织变白。
(3 ）转移到 25mL 棕色容量瓶中，用少量 80 ％丙酮冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入容量瓶中。最后用 80 ％丙酮定容至 25mL ，摇匀。离心或过滤。
(4 ）将上述色素提取液倒入光径 1cm 的比色杯内。以 80 ％丙酮为空白，在波长 663nm 、 645nm 、 652nm 和 440nm 下测定光密度。
（五）结果计算
将测得的光密度值代入公式，分别计算叶绿素 a 、 b 、 a+b 和类胡萝卜素的浓度（ mg ／ L ）。
并按下式计算组织中单位鲜重或干重的各色素的含量：
色素含量（ mg/g （ fw ）） = 色素浓度（ mg/L ） χ 提取液总体积（ mL ） / 样品重量（ g ） χ 1000
注意事项 ]
• 为了避免叶绿素光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些
（ 2 ）叶绿体色素提取液不能混浊
提取
叶绿素提取的准备工作是在一个半暗的房间里，室温保持在25℃。提取步骤如下：
(1) 取1000克新鲜的绿叶，在韦氏搅切器中粉碎。
(2)将粉碎的1000克绿叶放进加有少量的碳酸钙的丙酮中(温度20℃)进行萃取，直到过滤、清洗后的叶子碎片为无色。
(4)将石油醚溶液用蒸馏水再次净化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黄绿色悬浮液。
(5)用无水硫酸钠对悬浮液进行干燥，并将其渗入到3cm厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉类胡萝卜素，使之只含有天然的叶绿素。
(6)含有天然叶绿素的蔗糖柱分两层，绿层有4-10mm的叶绿素b层，另一蓝层为2-6mm的叶绿素a层。
(7)将位于蓝层正中的部分(约占蓝层的一半) 放入醚中，对此悬浮液进行过滤、洗提，用蒸馏水清洗，用硫酸钠干燥，再用器皿进行过滤后，得到叶绿素a。
(8)将(6)中的绿层中间部分移出，迅速放入醚中过滤、洗提，制成叶绿素b醚溶液。
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