分光光度法检测牛奶中钙铁锌含量

关键词：分光光度法；牛奶；蛋白质；钙；铁；锌；美析仪器www.macylab.com; V-1300

 

摘要：牛奶营养成分很高，富含蛋白质和微量元素钙、铁、锌等，是人们生活中的主要要营养食品之一。因此，分析牛奶中的营养成分含量是很有必要的工作。本实验在普通实验室条件，采用简单科学快捷的方法分析某品牌牛奶中部分成分含量。

1、实验目的

用分光光度法测某牛奶中蛋白质、钙、铁、锌的含量。

2、实验原理

牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

双缩脲(NH₂CONHCONH₂)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu²⁺反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH₂、-CH₂NH₂、-CS-NH₂等基团也有此反应。

钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe³⁺、Al³⁺等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

 

当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。

　　吸光度用A表示。

　　A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L

　　影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量。此外，温度通过影响c，而影响A。

　　符号A，表示物质对光的吸收程度。

邻二氮菲也叫邻菲啰啉，是测定微量Fe²⁺的高灵敏度显色剂在pH 2～9的条件下，Fe²⁺与邻二氮菲生成稳定的橙红色络合物，在510nm波长处有最大吸收。

该配合物的 lgk_稳 ＝ 21.3（20 ℃），摩尔吸光系数 ₅₁₀ =1.1×10⁴L·mol^-1·cm^-1 。 在显色前，首先用盐酸羟胺把 Fe³⁺ 离子还原为 Fe²⁺，其反应式如下：

2Fe³⁺+2NH₂OH·HCl ＝ 2Fe²⁺+4H⁺ +2Cl^- +N₂↑ +2H₂O

测定时，控制溶液的酸度在 pH＝5 左右较为适宜。酸度高时，反应进行较慢；酸度太低，则 Fe²⁺离子水解，影响显色。当铁浓度在5.0 mg／mL以内时，吸光度与Fe²⁺浓度呈直线关系。Bi³⁺、Cd³⁺、Hg⁹⁺、Ag⁺、Zn²⁺等离子在 pH ＝ 2~9 时与邻二氮菲生成沉淀。 Co²⁺， Ni²⁺， Cu²⁺等离子可与邻二氮菲形成有色配合物，故应注意它们的干扰。

锌是人体中必需的微量元素之一，锌缺乏会阻碍生长发育，过量又会导致胃癌等疾病。人类从牛奶等饮食中可以获得一定量的锌。在pH4.0～5.5的水溶液中，锌离子与双硫腙（C₁₃H₁₂N₄S）生成红色螯合物，摩尔吸光系数 ₅₃₅ =9.3×10⁴L·mol^-1·cm^-1用四氯化碳萃取后比色定量。在选定的pH条件下，用足够量的硫代硫酸钠可掩蔽水中存在的少量铅、铜、镉、钴、铋、镍、金、钯、银、亚锡等干扰金属离子。

3、实验步骤

 3.1、试剂的配制、仪器准备

3.11、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液的配制:

先配A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。

取醋酸钠固体6.5461g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸5mL加水稀释至100ml，混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液200mL。

3.12、乙醇—乙醚混合液的配制：取25ml95％乙醇与25ml无水乙醚混合

3.13、双缩脲试剂：称取CuS0₄·5H₂O 0.3g，酒石酸钾0.9 g和碘化钾0.5g，分别溶解后混匀，加6 mol·L^-1NaOH 10mL，最后加水至100mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。

3.14、蛋白质标准液(10mg·mL^-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mol/L NaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容）

3.15、铁标准溶液(40.0µg·mL^-1)：:准确称取0.0345g硫酸铁铵〔 NH₄ Fe (SO₄)₂·12H₂O〕于烧杯加入6mL6 mol·L^-1 HCl 和少量水，溶解后用纯水定容至10mL。此溶液1.00mL含有40.0µg铁。

3.16、盐酸羟胺溶液(100 g·L^-1)：:称取10g盐酸羟胺(NH₂OH·HCl)，溶于水，并稀释至100m（新鲜配制，两周内有效）

3.17、邻二氮菲溶液(2g·L^-1):：称取0.20g邻二氮菲(C₁₂H₈N₂·H₂O)，溶解于加有2滴浓盐酸的纯水，并稀释至100mL（新鲜配制，两周内有效）

3.18、醋酸钠溶液（1.0 mol·L^-1）：:称取8.2030g醋酸钠，用纯水溶解后稀释至100mL。

3.19、锌标准溶液（1.00µg·mL^-1）：准确称取0.0100g基准锌于100mL烧杯中，加入6 mol·L^-1HCl 0.5mL，立即盖上表面皿，待锌完全溶解后，以少量水冲洗表面皿及烧杯壁，将溶液转入100mL容量瓶中，定容，即为锌标准贮备溶液。准确移取1mL锌标准贮备溶液，稀释定容至100.0mL，即得1.00µg·mL^-1锌标准溶液。

3.20、0.1％双硫酸腙四氯化碳贮备溶液：称取0.10g双硫腙（C₁₈H₁₂N₄S），在干燥的烧杯中用四氯化碳溶解后稀释至100 mL， 倒入棕色瓶中。此溶液置冰箱内保存，可稳定数周。

3.21、双硫腙四氯化碳溶液：临用前，吸取适量双硫腙四氯化碳贮备溶液，用四氯化碳稀释约30倍，至吸光度为0.4（波长535 nm，1cm比色皿）。

3.22、25％硫代硫酸钠溶液：称取64.60g硫代硫酸钠（Na₂S₂0₃·5H₂0)，溶于100mL纯水中。

3.23、1＋1 氨水溶液:10ml氨水加10ml水稀释

3.24、V-1300型可见分光光度计

3.2、牛奶中酪蛋白的提取

3.21、酪蛋白的粗提

    50mL鲜牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液50mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r ·min^-1）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。

3.22、酪蛋白的纯化

用水洗涤沉淀3次，离心10分钟（3000r·min^-1），弃去上清液。在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。

3.3、酪蛋白含量的测定

3.31、标准曲线的绘制与样品的测定

取试管8支，按下表操作。

各管混匀、放置37℃水浴中保温20min。540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。

3.32、计算

在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

3.4钙含量的测定

3.41、钙制剂钙含量的测定

准确移取25ml的鲜牛奶和钙奶，分别转移到100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

准确移取上述试液20.00mL，加入三乙醇胺溶液5mL，5mol·L^-1NaOH 4mL，加入水20mL，摇匀，加铬蓝黑R8~10滴，用0.01mol·L^-1EDTA标准溶液滴定，接近终点时再补加2～3滴铬蓝黑，当溶液由红色变为蓝色即为终点，根据消耗EDTA的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量（g/100 mL），并与包装上注明的含量作比较。

3.42、注意事项

量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗0.01 mol·L^-1EDTA体积为20~30 mL。牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加2～3滴指示剂。

3.5铁含量的测定

3.51、标准曲线的绘制

取25mL比色管6支，按下表顺序配制铁标准系列并记录测量的数据（注意：加入盐酸 钱干后需摇匀放置2 min，再进行下一步操作），加完试剂后摇匀，放置37℃水浴中保温15min，以空白液为参比，在510nm下测定各溶液的吸光度值。

取25mL比色管2支，按照上表及上述方法测定510 nm下的吸光度值。

3.52、计算

     在电脑上以吸光度值为纵坐标，以铁质量浓度（µg·mL）浓度为横坐标绘制标准曲线。

利用标准曲线计算鲜奶中铁的含量（mg/100mL）。

3.53、样品的测定

将50ml鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。除去水份后, 强烈加热至450~550℃ 1小时。冷却后, 加1 mL浓硝酸蒸发近干, 重新在450~550℃灼烧（不能溅出）。用少量稀硝酸溶解白色残液, 转入10mL容量瓶中稀释至刻度, 用稀氢氧化钠溶液调pH=7~8。

3.6锌含量的测定

3.61、标准曲线的绘制与样品的测定

   将70ml鲜奶一滴一滴加到热坩埚中避免沸腾蒸发。除去水份后, 强烈加热至450~550℃ 1小时。冷却后, 加1 mL浓硝酸蒸发近干, 重新在450~550℃灼烧（不能溅出）。用少量稀硝酸溶解白色残液, 转入10mL容量瓶中稀释至刻度, 用稀氢氧化钠溶液调pH=7~8。再用蒸馏水稀释到25ml.

可准确吸取1ml水样，用纯水稀释至10.0mL。

另取分液漏斗8个，依次加入锌标准溶液0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00和5.00mL，各加纯水至10mL。

向水样与标准系列分液漏斗中各加1滴甲基红指示剂，用1＋1氨水调节溶液刚显黄色，再滴加乙酸溶液至红色（pH约4.4）。加5mL四氯化碳，振摇萃取甲基红，弃去有机相。

向各分液漏斗中加入5.0mL缓冲溶液混匀，再加入1.0mL硫代硫酸钠溶液，混匀，再加入10.0mL双硫腙四氯化碳溶液，强烈振荡4min，静置分层。

用脱脂棉或卷细的滤纸擦去分液漏斗颈内的水，弃去最初放出的2～3mL有机相，收集随后流出的有机相于干燥的10mL比色管内。于535nm波长下，用1cm比色皿，以四氯化碳为参比，测定样品和标准系列溶液的吸光度。绘制校准曲线，在曲线上查出样品管中锌的含量。

注：①本法测锌要特别注意防止外界污染，同时还要避免在直射阳光下操作。

②加入硫代硫酸钠除了掩蔽干扰金属离子的作用外，同时也兼有还原剂的作用，保护双硫腙不被氧化。由于硫代硫酸钠也能与锌离子络合，因此标准系列中硫代硫酸钠的加入量应与样品管一祥。

③振荡时间必须充分，因硫代硫酸钠是较强的络合剂，只有使锌从络合物 Zn(S₂O₃)^2-中释放出来，才能被双硫腙四氯化碳溶液萃取。而锌的释放又比较缓慢，因此振荡时间要保证4min，否则萃取不完全。为了使样品和标准的萃取率一致，应尽量做到振摇强度、次数一致。

 

4．数据处理

4.1牛奶中酪蛋白的提取、

酪蛋白含量:6.1354g/100ml

得率=

4.2酪蛋白含量的测定

4.21、标准曲线的绘制与样品的测定

	1	2	3	4	5	6	待测牛奶液	待测酪蛋白
蛋白质标准液(mL)	－	0.20	0.40	0.60	0.80	1.00	－	－
待测蛋白样品(mL)	－	－	－	－	－	－	1.00	1.00
0.9%NaCl(mL)	1.00	0.8	0.60	0.40	0.20	-	－	－
双缩脲试剂(mL)	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
蛋白质浓度（g/L）	0	0.4	0.8	1.2	1.6	2.0	4.957	3.094
吸光度A	0	0.099	0.196	0.300	0.401	0.508	1.254	0.7816

4.22、计算

在电脑上以吸光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查出待测样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出100mL鲜牛奶中酪蛋白的真实含量。

故拟合所得y=-0.0029+0.25357x,相关系数r=0.99988

 

4.3钙含量的测定

4.31、钙制剂钙含量的测定

 

100ml鲜奶含钙量：

鲜奶包装上含钙量为100ml鲜奶含0.102g~0.107g钙与测量结果基本相符

100ml高钙奶含钙量：

而高钙奶包装注明含钙量为100ml高钙奶含0.130g~0.140g钙远远高于测量结果，说明高钙奶含钙量名不符实。

4.4铁含量的测定

4.41、标准曲线的绘制

	1	2	3	4	5	6	测定管1	测定管2
铁标准溶液(mL)	0.00	0.50	1.00	1.50	2.00	2.50	－	－
待测铁溶液	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	1.00	1.00
盐酸羟胺溶液(mL)	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
邻二氮菲溶液(mL)	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
醋酸钠溶液(mL)	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
铁溶液浓度（ ）	0.00	0.80	1.60	2.40	3.20	4.00	0.294	0.203
蒸馏水(mL)	稀释至25mL
吸光度	0	0.177	0.377	0.581	0.709	0.874	0.077	0.057

故拟合所得y=0.01229+0.22036x,相关系数r=0.99773

当吸光度y=0.077时，铁溶液浓度x=0.294

当吸光度y=0.057时，铁溶液浓度x=0.249

故其平均值为0.249

每100ml鲜奶中铁含量为0.249 =0.125mg

4.5锌含量的测定

4.51、标准曲线的绘制与样品的测定

 

 

 

 

 

故拟合所得线性方程为y=0.12306+0.67912x,相关系数r=0.99292

且当吸光度y=0.368时，待测样浓度x=0.361

故每100ml鲜牛奶含锌量为0.361

5、讨论分析

  5.3钙含量测定

      鲜奶包装上含钙量为100ml鲜奶含0.102g~0.107g钙与测量结果0.107基本相符

而高钙奶包装注明含钙量为100ml高钙奶含0.130g~0.140g钙远远高于测量结果 ，虽然滴定到终点时颜色变化比较不明显，消耗的EDTA的量有一定误差，但即使是这样求出的含钙量也不会这么低，所以说高钙含钙量没有如包装上所说那么多。实验注意事项考虑到牛奶中含有Fe³⁺、Al³⁺等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。

5.4 铁含量的测定

   实验所测铁含量为0.125mg/100ml远远低于包装上所说0.3mg/100ml,原因可能由于牛奶灼烧不够充分，导致部分残液不溶，致使所得样品偏少，但也有可能是本身牛奶液中含铁量与包装上不符实。本实验应注意的事项牛奶的灼烧，需一滴一滴的加，防止沸腾蒸发，而且溶液的酸度要控制在7到8之间为宜，酸度太高，反应进行较慢，酸度太低，则二价铁离子水解，影响显色。

5.5 锌含量的测定

   实验所测锌含量为0.123mg/ml远远低于包装上所说的0.40mg/100ml，可能由于该方法测锌对实验条件要求较高，要避免外界污染，同时要避免光直照，而且在萃取锌的时候要求振摇强度，次数一致，而实际过程中是很难做到的。故绘出的标准曲线有一定误差。