紫外分光光度法测定蛋白质含量

关键词：蛋白质；紫外分光光度法；美析仪器www.macylab.com；UV-1700PC

一、实验目的 

1、 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理; 

2、 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;  

3、 掌握UV-1700PC紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。 

二、实验原理 

紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。 

进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。      

定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。由于最大吸收波长λmax处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax的吸光度，以获得最大灵敏度。 

光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I0，通过待测溶液的透光强度为I，根据上式，由仪器直接给出I0与I之比的对数值即吸光度。 

紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即 

由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。

本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：

（1）蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275 280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。

（2）此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3—3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。

（3）有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算：

蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260

(A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)

还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量：

蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d

其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色皿的厚度（cm）;D为溶液的稀释倍数；F为校正因子

（4）稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200—250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。常用下列经验公式：

蛋白质浓度（mg/mL）=0.144（A215-A225）

（A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值）

三、仪器与试剂

仪器：UV-1700PC紫外-可见分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。

试剂：标准蛋白质溶液：3.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液。

四、实验步骤 

〈一〉   准备工作 

1．启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。    

2. 在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。 

3. 将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。 

4. 标准曲线的制作。  

〈二〉测量工作  

1.吸收曲线的绘制:用吸量管吸取2mL3.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl

溶液稀释至刻度，摇匀。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液为参比，在190 nm～400nm区间，测量吸光度。   

2.标准曲线的制作：用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 3.00 mg.mL^-1标准蛋白质溶液于5只10 mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光度A278 记录所得读数。

 3.样品测定：取适量浓度的待测蛋白质溶液3 mL，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀，按上述方法测定278nm处的吸光度。平行测定三份。

五、数据处理： 

1.以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，找出最大吸收波长。

由吸收曲线可得最大吸收波长λmax=278nm

2.以标准蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

待测蛋白质的吸光度

平均浓度=0.641088  mg/mL

SD= 0.009434

RSD= 1.4715%

当置信度为P=95%时,f=2,t0.95,2=4.3

在误差允许的范围内，蛋白质的含量为0.641088mg/mL

六、思考题

紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法有何优缺点？受哪些因素的影响和限制？

答：优点：方法操作简便、迅速、不需要复杂和昂贵的设备，不消耗样品，测定后仍能回收利用，低浓度的盐和大多数缓冲溶液不干扰测定。

缺点：准确度和灵敏度差一点。干扰物质多；对于测定那些与标准蛋白质中铬氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会产生较大干扰。

干扰因素：主要受溶剂的影响。

七，实验总结与反思。

相比于上一个邻二氮菲分光光度法测定微量铁的实验来说，这个实验的操作步骤是相当的简单，出错的几率也小。最后测出样品的吸光度要比另一组的大的原因，我想可能是标准蛋白质溶液的问题，我们两个小组用的不是一个容量瓶中的标准蛋白质溶液，他们组使用的是新配置的，我们小组使用的是之前遗留下来的，而且只剩下一点点，但是足够我们做这次实验的量，我想很有可能是蛋白质沉积在了底部，每次使用前没有轻轻的混合均匀，导致底部浓度偏大，最后就影响到了我们待测溶液的浓度的测定。

关键词：蛋白质；紫外分光光度法；美析仪器www.macylab.com；UV-1700PC