双填料固相萃取-紫外分光光度法检测茶汤中农药残留

关键词:溴氰菊酯，吡虫啉，双填料固相萃取，紫外分光光度计，茶汤；美析集团 www.macylab.com

  摘要:以沉淀聚合法制备溴氰菊酯和吡虫啉分子印迹聚合物，然后干法裝柱制备双填料固相萃取柱考察其吸附性能，利用紫外分光光度计确定溴氰菊酯和吡虫啉的最大吸收波长，采用扫描电子显微镜对聚合物进行表征。实验结果表明溴氰菊酯在220nm处吸收峰较大，而吡虫啉在270nm处有最大吸收峰，且两种聚合物均具有较好的吸附能力。溴氰菊酯和吡虫啉在10～60mg/L浓度范围内线性关系良好(Ｒ2＞0.99)，当以甲醇为活化溶剂、1mL/min的流速上样、10%乙酸甲醇溶液作为洗脱剂时，该萃取柱对不同茶汤中溴氰菊酯和吡虫啉的加标回收率分别为83.15%～110.19%和80.61%～90.73%。对萃取柱8次重复利用结果证明该双填料萃取柱具有较好的再生性，可应用于茶叶中溴氰菊酯和吡虫啉农药的定量检测。

  随着高毒有机磷农药相继被禁用、淘汰甚至退出市场，拟除虫菊酯类农药和烟碱类杀虫剂凭借杀虫谱广、高效等优点逐渐成为主要的替代品并广泛应用于农业生产和公共卫生领域。但该类农药可通过皮肤吸附、口腔摄入等方式进入人体内，对人体具有一定的致突变和致癌风险。因此，开展农产品中农药残留技术研究，可为保障农产品安全等提供技术支持。目前，菊酯类和烟碱类农药的检测方法主要有GC、LC－MS和GC－MS等仪器分析方法。然而由于此类农药通常以痕量形式存在于复杂样品中，导致在进行多残留检测时存在萃取分离过程复杂，富集效果不好等问题。分子印迹固相萃取(MolecularlyImprintedSolidPhaseExtraction，MISPE)是将具有专一性、高度选择性的分子印迹聚合物作为萃取填料，能够选择性浓缩痕量待测物，进而提高分离效率和分析准确性，因此被广泛应用于食品、饲料中的抗生素及农药残留分析。其中，Tang等以吡虫啉印迹聚合物作为填料制备固相萃取柱，并成功地应用于水和土壤中吡虫啉的富集检测;Martins等以溴氰菊酯分子印迹聚合物作为填料制得的分子印迹固相萃取柱实现了从橄榄油样品中选择性分离/预浓缩出溴氰菊酯。但目前相关农残检测的研究大多数集中在制备单填料固相萃取柱来分离富集复杂样品中的痕量目标分析物，而通过制备双填料固相萃取柱以实现两种农药残留同时检测的研究未见报道。

  本研究以拟除虫菊酯类和烟碱类农药中毒性强、应用范围广的溴氰菊酯和吡虫啉为模板分子分别制备溴氰菊酯分子印迹聚合物和吡虫啉分子印迹聚合物，并以此两种聚合物作为固相萃取材料，建立双填料固相萃取柱以实现茶汤中溴氰菊酯和吡虫啉农药的同时检测，以期为采用双填料分子印迹固相萃取技术去除检测食品中农药残留的研究提供理论依据与数据支持。

一、材料和方法

1.1 材料与仪器

溴氰菊酯、(质量分数＞98%);

吡虫啉(纯度95%);

绿茶、铁观音、英德红茶(干茶叶);

红茶饮料;

丙烯酸(acrylicacid，AA);

丙烯酰胺(acrylamide，AM)、

乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA);

偶氮二异丁腈(AIBN);

甲醇、冰乙酸、乙腈、丙酮、乙醇、二氯甲烷。

调速振荡器;

磁力加热搅拌器;

紫外-可见分光光度计;美析集团 www.macylab.com

隔膜真空泵;数显恒温水浴锅;

扫描电子显微镜。

1.2  实验方法

1.2.1 分子印迹聚合物的制备

1.2.1.1溴氰菊酯分子印迹聚合物的制备参照本课题组前期实验成果，采用沉淀聚合法制备溴氰菊酯分子印迹聚合物。称取1.010g溴氰菊酯、0.569gAM于锥形瓶中，再加入80mL乙腈溶解，置于磁力搅拌器上于28℃条件下低速搅拌1h，使模板分子与功能单体充分作用。然后加入7.920g交联剂EGDMA和1.314g引发剂AIBN，继续磁力搅拌10min，使超分子配合物与交联剂和引发剂充分接触，混合均匀，形成透明体系。并在功率为100Hz，温度为10℃条件下超声脱气10min后将混合物转移至三口烧瓶中，在60℃恒温水浴锅中机械搅拌反应24h，搅拌速度控制在100～200r/min。

对所得聚合物进行抽滤，并用无水乙醇和蒸馏水各清洗2次，于65℃烘箱中干燥12h;以甲醇－乙酸溶液(体积比1∶1)作为洗脱溶剂，85℃恒温抽提10h以除去模板分子，用甲醇洗去乙酸后再用蒸馏水反复清洗聚合物，最后将其置于65℃烘箱中干燥12h至质量恒定，得到的白色粉末状聚合物即为溴氰菊酯分子印迹聚合物(DMMIPs)。非印迹聚合物(non－imprintedpolymers，NIPs)的制备及处理方法同MIPs，但不加入模板分子。

1.2.1.2吡虫啉分子印迹聚合物的制备参照本课题组前期实验成果，采用悬浮聚合法制备吡虫啉分子印迹聚合物。称取0.511g吡虫啉、0.576gAA加入装有150mL甲醇的锥形瓶中，置于磁力搅拌器上于28℃条件下低速搅拌1h，使模板分子与功能单体充分作用。然后加入交联剂9.910gEGDMA和0.050gAIBN，继续搅拌10min，使超分子配合物与交联剂和引发剂充分接触。最后转移到三口烧瓶中，在70℃恒温水浴锅内反应24h，搅拌速度控制在(100～200)r/min。对所得悬浊液进行抽滤，用无水乙醇和蒸馏水各清洗2次，70℃干燥12h使所得产物呈白色粉末状，然后用丙酮溶液于65℃恒温抽提8h以除去模板分子，再用蒸馏水反复清洗聚合物，最后将其置于70℃烘箱中烘干至恒重，得到的白色粉末状物质即为分子印迹聚合物(MIPs)。NIPs的制备及处理方法同MIPs，但不加入模板分子。

1.2.2确定最大吸收波长

分别配制浓度为10mg/L溴氰菊酯甲醇标准溶液和吡虫啉甲醇标准溶液，利用紫外－可见分光光度计在400～190nm范围内进行全波长扫描。

1.2.3分子印迹聚合物的表征      

将溴氰菊酯分子印迹聚合物和吡虫啉分子印迹聚合物进行喷金处理后，用扫描电子显微镜观测其形貌特征。

1.2.4固相萃取分析

1.2.4.1溴氰菊酯吡虫啉混合液标准曲线的绘制

分别称取溴氰菊酯和吡虫啉5、10、15、20、25、30mg的于100mL容量瓶中，加入乙腈定容并摇匀，作为工作液。用移液枪分别移取1mL工作液于一组10mL试管中，各加入乙腈定容并摇匀，即配得浓度为10～60mg/L的溴氰菊酯吡虫啉混合溶液。用分光光度计在220、270nm波长处测定相应浓度下溴氰菊酯、吡虫啉的吸光度，平行测定3次，取平均值，并绘制吡虫啉、溴氰菊酯混合标准曲线。

1.2.4.2双填料固相萃取柱的制备

首先称取0.100g溴氰菊酯MIPs作为填料，采用干法装柱法将其填充入底部装有筛板的聚丙烯外壳的固相萃取柱内，然后取另一筛板置于溴氰菊酯MIPs上方;再称取0.150g吡虫啉MIPs作为第二层填料，采用同样的方法填充入固相萃取柱中，装好填料后，取同样筛板置于柱体使其在填料上表面固定，即制得双填料固相萃取柱。1.2.4.3茶汤的制备及红茶饮料的处理称取3.000g经研磨后的干茶叶(红茶、绿茶及铁观音)置于500mL锥形瓶中，加入沸蒸馏水450mL，沸水浴45min，每隔5min摇匀一次。浸提完毕后立即进行抽滤，待滤液冷却至室温后移至500mL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度线即制得茶汤溶液。购于市场的红茶饮料直接作为茶汤进行后续研究。

1.2.4.4不同茶汤中溴氰菊酯和吡虫啉含量的测定

以建立的双填料固相萃取技术对不同茶汤中溴氰菊酯和吡虫啉含量进行检测，固相萃取实验之前，先用5mL甲醇溶液对分子印迹固相萃取柱采用直接淋洗的方式进行活化处理。取含有一定浓度溴氰菊酯吡虫啉的茶汤溶液上固相萃取柱，用5mL正己烷溶液淋洗后，再取5mL10%乙酸甲醇进行特异性洗脱，流速均控制在1mL/min，收集洗脱液，用10mm比色杯，分别在波长220和270nm下用紫外分光光度计测定吸光度，根据标准曲线计算洗脱液中溴氰菊酯和吡虫啉的浓度。由下式计算固相萃取过程中溴氰菊酯和吡虫啉的加标回收率。

式中:Cs为平衡吸附后溶液中目标物(Cs0)质的浓度，mg/L;Cs0为目标物质的起始浓度，mg/L。

1.2.4.5双填料MISPE再生性评价装填一只新的固相萃取柱，安装在固相萃取装置上，采用1.2.4.4方法对萃取柱进行活化、上样、淋洗和洗脱，萃取过程中流速均为1mL/min，收集洗脱液，吸干后再进行下次重复加样萃取实验，共重复8次。利用紫外分光光度计分别测定8次洗脱液中溴氰菊酯和吡虫啉的吸光度，由1.2.4.4中公式计算固相萃取过程中溴氰菊酯和吡虫啉的加标回收率。

1.3   数据处理

所有实验至少重复三次并采用平均值，采用

Origin8.5软件进行作图。

二、结果与分析

2.1 确定最大吸收波长

溴氰菊酯和吡虫啉最大吸收波长测定结果如图1(a)、图1(b)所示。由图1可知，溴氰菊酯在220nm处吸收峰较大，而吡虫啉在270nm处有最大吸收峰。故分别选择波长220和270nm测定溴氰菊酯和吡虫啉的吸收值。

2.2分子印迹聚合物的表征

沉淀聚合所得溴氰菊酯和吡虫啉分子印迹聚合物的扫描电镜图如图2所示。由图2(a)、(b)可知，所制备的溴氰菊酯MIPs和吡虫啉MIPs均具有较规整的形貌，粒径较小且分布相对均匀，微球结构导致比表面积较大，使其具有较好的吸附能力。

2.3双填料分子印迹固相萃取性能

2.3.1溴氰菊酯、吡虫啉溶液标准曲线

根据1.2.4.1的方案配制溴氰菊酯吡虫啉标准溶液，测其紫外吸收绘制吸光度－浓度的标准曲线。得溴氰菊酯溶液线性方程y=0.0417x+0.1077，Ｒ2=0.9972;吡虫啉溶液线性方程y=0.041x+0.0514，Ｒ2=0.9981。溴氰菊酯、吡虫啉溶液标准曲线图如图3(a)、(b)所示。

2.3.2 固相萃取条件的优化

本实验以溴氰菊酯MIPs和吡虫啉MIPs作为填料制备双填料固相萃取柱，考察不同活化溶剂、洗脱溶剂、上样浓度和流速对溴氰菊酯和吡虫啉加标回收率的影响。

2.3.2.1活化溶剂的选择

对活化溶液进行优化不仅可以保证固相萃取柱的保留性能，并且可以增强聚合物内识别位点的活性。本实验选用甲醇、50%甲醇水溶液和20%乙腈水溶液作为活化溶剂，考察不同活化溶剂对溴氰菊酯和吡虫啉加标回收率的影响。结果如图4所示。由图4可以看出，当甲醇作为活化溶剂时，溴氰菊酯和吡虫啉的加标回收率分别达到88%和82.04%，优于其他两种活化剂。这是因为分子印迹聚合物的有效印迹位点为聚合物于模板分子间形成的氢键，而自带－OH的甲醇能够有效的将印迹聚合物的有效印迹位点活化，达到对目标分子选择性吸收的目的，从而使目标物质尽可能的被填料吸附，故选择聚合溶剂甲醇为活化剂进行后续试验。

2.3.2.2洗脱溶剂的选择

洗脱是通过干扰结合和强力溶解作用，破坏模板分子与印迹孔穴中结合位点的作用力，从而将目标物洗脱解离的过程。本实验选择了乙腈、乙酸乙酯和10%乙酸－甲醇作为洗脱溶剂，考察MISPE对溴氰菊酯和吡虫啉的加标回收率影响。由图5可知，在三种洗脱剂中，10%乙酸－甲醇作为洗脱溶剂时得到的溴氰菊酯和吡虫啉加标回收率较高，这是由于乙酸对甲醇起到极性修饰作用，乙酸的羧基同功能单体竞争性地与模板分子作用，破坏模板分子与印迹位点间的离子键及氢键作用，使目标分析物从萃取材料表面较容易的洗脱下来。而乙酸乙酯和乙腈均属于非质子型溶剂，很难通过破坏聚合物与目标分子之间的作用力将目标分子有效快速地洗脱，因此洗脱效果相对较差。

故选用10%乙酸－甲醇作为洗脱溶剂。

2.3.2.3上样浓度的选择

为确定样品浓度对双填料MISPE吸附效果的影响，分别取浓度10、20、30、40、50mg/L的溴氰菊酯吡虫啉溶液上样，结果见图6。由图6可知，在上样浓度10～50mg/L范围内，加标回收率随着上样浓度的增加呈逐渐增大的趋势，并在50mg/L时回收率达到最大，这是由于已吸附于聚合物上的模板分子对溶液中的目标物质的吸附起到表面堆积的协同作用。当上样浓度为30mg/L时，溴氰菊酯和吡虫啉的加标回收率均达到80%以上。根据农残检测标准，加标回收率达到80%以上即符合要求，故选择30mg/L作为样品上样浓度。

2.3.2.4 柱流速的选择

柱流速会影响目标物与MISPE的接触时间，从而影响目标物的结合率。本实验考察MISPE在流速分别为1、3、5mL/min时对溴氰菊酯和吡虫啉的结合性能，如图7所示。结果表明，MISPE对溴氰菊酯和吡虫啉的加标回收率随着柱流速的增大而逐渐降低。这是因为在低流速条件下，目标物质可与填料充分作用，结合率较高;而流速过快，待测物尚未与吸附剂相互作用就被溶剂带出，导致回收率降低，故选择流速为1mL/min。

2.3.3茶汤及红茶饮料中溴氰菊酯和吡虫啉含量的检测

根据1.2.4.3所述方法制备茶汤，通过本实验建立的双填料固相萃取－紫外分光光度法检测红茶、绿茶、铁观音和红茶饮料的茶汤中溴氰菊酯和吡虫啉含量。根据1.2.4.4方法探究双填料分子印迹固相萃取对不同茶汤中溴氰菊酯和吡虫啉的吸附性。由图8可知，所制得的双填料固相萃取柱对茶汤中两种加标农药均具有较好的回收率，其中对溴氰菊酯的加标回收率为83.15%～110.19%，这与樊玮等利用单填料萃取柱检测茶叶中溴氰菊酯的回收率(90.5%～102%)相差不大;对吡虫啉的加标回收率为80.61%～90.73%，虽然与本课题组前期仅利用吡虫啉分子印迹聚合物作为填料制备固相萃取柱测得的茶汤中吡虫啉回收率(97.2%～98.4%)相比稍低，但能实现两个组分的同时检测，符合农药残留检测要求。说明本研究所制备的双填料固相萃取柱对不同茶汤中的模板分子均具有较好的专一性和特异吸附性，能用于不同种类茶汤等复杂基质中痕量成分的富集提纯。

2.4双填料MISPE再生性评价

选取浓度为30mg/L的上样溶液对双填料固相萃取柱进行上样，按照最佳条件吸附、洗脱，回收率与萃取柱使用次数的关系见图9。由图9可知，对双填料MISPE进行第一次样品萃取和洗脱处理后，溴氰菊酯和吡虫啉的回收率分别为88%和82.04%，重复使用8次后，溴氰菊酯和吡虫啉的回收率稍有下降至85.98%、80.45%，但均符合农残检测标准。说明该方法制备的双填料分子印迹固相萃取柱具有良好的稳定性和再生性。

三、结论

本文以优化合成的溴氰菊酯分子印迹聚合物和吡虫啉分子印迹聚合物作为吸附剂制备双填料固相萃取柱，通过动态吸附实验确定最佳固相萃取条件为:流速1mL/min，甲醇为活化溶剂，10%的乙酸甲醇溶液为洗脱溶剂，上样浓度为30mg/L。在最优的萃取条件下，制备的材料对不同茶汤中的溴氰菊酯和吡虫啉均具有较好的富集萃取效果。经过8次循环实验后溴氰菊酯吡虫啉的回收率并没有明显下降，说明该固相萃取柱的重复再生性好。相对于传统的单填料萃取柱，制备的双填料固相萃取柱能实现两个组分的同时检测且符合农残检测要求，有望作为茶叶等复杂基质分析检测前的富集提纯材料，为采用双填料分子印迹固相萃取技术探索食品中农药残留的分析提供了一种新思路。

四、文献出处及鸣谢
本文主要内容部分出自：1.双填料固相萃取-紫外分光光度法检测茶汤中农药残留；谢雷，吴婉仪，李璐*，解新安，李雁