NBT法测定超氧化物岐化酶(SOD)的应用方案(分光法）

NBT法测定超氧化物岐化酶(SOD)的应用方案(分光法）

原理

SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD: Mn—sOD和cu.Zn—SOD，它们都催化下列反应:

由于超氧自由基(O₂）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子0₂一..一，当加入NBT后，在光照条件下，

与超氧自由基反应生成单甲攒（黄色)，继而还原生成二甲攒，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H结合生成H₂0₂和O₂，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲攒生成速度减慢。

在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。

仪器及试剂

美析UV-1500紫外可见分光光度计

0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8):

A母液:0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取 Na2HPO412H2O(分子量358.14)71.7g;B母液:0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS(pH7.8）的配制:分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，

B母液(NaH₂PO₄)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

14.5mM甲硫氨酸溶液:称取1.0818g Met用磷酸缓冲液（pH7.8)定容至500ml。

3mM EDTA-Na2溶液:称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

60 uM核黄素溶液:称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液:称取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。

实验步骤

酶液提取

称取0.5g(可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液( pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。

酶活性测定

(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na₂溶液6ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀;

(2）分别取2.9ml反应混合液和0.1ml（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管;同时做两支对照管，其中1支试管加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS(不加酶液〉作为最大光还原管，另1支加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。

(3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应20min;

(4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm 下的吸光度（OD560)

计算结果

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位(U)，按下式计算活性n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2

SOD总活性=[(Ack-AE)×V]/(1/2Ack×W×Vt)SOD 比活力=SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g Fw);比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;

Ack为照光对照管的吸光度;

AE为样品管的吸光度;

V为样品液总体积（ml);

Vt为测定时的酶液用量(ml);

W为样品鲜重(g>;

蛋白质含量单位为mg/g。

注意事项

1.酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降;

2.植物中的酚类物质对测定有干扰,制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP）或pvpp 等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。

3.NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。

4．加反应液时最好在暗光下进行;

5.核黄素产生O2，NBT还原为蓝甲h都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40u molms，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做)(温度高时照光时间缩短，温度低时延长);

6.测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50%为佳。(一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量,即以能抑制反应50%的酶量为一个 SOD酶活性单位。)

(反应液中加酶液与PBS 调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法:2支CK管均以缓冲液代替酶液)

仪器参数

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